Ad-Egr-hTrail聯(lián)合放射線對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)性研究

劉桂紅 章龍珍 唐天友 劉美艷 趙麗

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，約占全部顱內(nèi)腦腫瘤的35% ～40%。目前，膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)、放療為主。由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以徹底切除，而且某些腫瘤生長(zhǎng)于重要的腦功能區(qū)，多為手術(shù)禁區(qū)，使得放射治療成為腦膠質(zhì)瘤綜合治療中一個(gè)重要的輔助方法。但膠質(zhì)瘤對(duì)射線較抗拒，加上正常腦組織耐受劑量的限制，導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤放射治療的總體療效不理想。

腫瘤基因-放射治療目的就是試圖通過(guò)提高腫瘤的輻射敏感性的同時(shí)降低正常組織的輻射損傷開(kāi)辟新的治療途徑與方法。研究發(fā)現(xiàn)Egr-1啟動(dòng)子可誘導(dǎo)輻射敏感性，而TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)正常組織無(wú)損傷，因此若將兩者共同構(gòu)建表達(dá)調(diào)控體，就能很好地達(dá)到腫瘤基因-放射治療的目的。因此本實(shí)驗(yàn)在以CMV作為啟動(dòng)子的腺病毒重組載體Ad-CMV-hTrail作為對(duì)照的基礎(chǔ)上，研究Ad-Egr-hTrail單獨(dú)及聯(lián)合放射線對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，為臨床腦膠質(zhì)瘤基因-放射治療進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 攜帶人TRAIL基因的增殖缺陷型腺病毒重組載體Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室葛盛芳博士惠贈(zèng)，U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)自中科院生物細(xì)胞學(xué)研究所。MTS檢測(cè)試劑盒(Promega);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)。PCR反應(yīng)試劑盒(Fermentas公司);100bp Marker(天為時(shí)代公司);引物序列由上海生物工程公司合成：

上游引物(P1)：5＇-GCTGCCTGGCTGACTTACA-3＇，下游引物 (P2)：5 ＇-TGGCTGGTCTAGACAGATTGC-3 ＇，擴(kuò) 增 片 斷為1037bp。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組腺病毒的擴(kuò)增 、純化和滴度測(cè)定 將攜帶Ad-Egr-hTrail的293包裝細(xì)胞從-70℃冰箱取出，-70℃/37℃反復(fù)凍融3次，以裂解細(xì)胞，釋放重組病毒。將上述細(xì)胞裂解液移至離心管中，12000rpm，離心10 min。吸取含病毒的上清液，感染AE25 crma細(xì)胞，大量擴(kuò)增重組腺病毒。Ad-CMV-hTrail擴(kuò)增方法同上。然后純化及滴度測(cè)定。

1.2.2 重組腺病毒的PCR鑒定 為了檢測(cè)重組腺病毒是否攜帶目的基因Trail，裂解腺病毒，提取重組病毒基因組 DNA，以上述病毒DNA為模板，加入引物P1和P2于 PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：先95℃預(yù)變性5 min;接著94℃ 1 min;60℃1 min;72℃ 90 s;再72℃ 延伸10 min，共30個(gè)循環(huán)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分成6組：空白對(duì)照組，Ad-EgrhTrail組(Egr組)，Ad-CMV-hTrail組(CMV 組)，Ad-Egr-hTrail+照射組(Egr+照射組)，Ad-CMV-hTrail+照射組(CMV+照射組)，單純照射組。

1.2.4 病毒感染 取指數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1×104細(xì)胞/孔，每孔 100 μl，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，48 h后用移液器先將培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液吸盡，然后每孔加入50 μl新鮮培養(yǎng)液。將Ad-CMV-hTrail及Ad-Egr-hTrail按MOI=100分別感染U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，無(wú)病毒感染組(對(duì)照組，單純放療組)加入等量的PBS液，使病毒與細(xì)胞充分接觸，置于孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。病毒感染腫瘤細(xì)胞2 h后，每孔再補(bǔ)加50 μl新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。感染2 d后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞感染情況，并拍照。

1.2.5 照射條件 病毒感染2 d后給予12 Gy-X射線一次性照射，無(wú)照射組給予0 Gy-X射線假照射。SSD=100，劑量率0.684 Gy/min。

1.2.6 MTS法測(cè)定 MTS法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率。將Cell-Titer 96 aqueous one solution reagent置于室溫，使試劑完全解凍，備用。吸棄培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，每孔內(nèi)加入100 μlDMEM和 20 μl的 CellTiter 96 aqueous one solution reagent(同時(shí)以只含 100 μlDMEM 和 20 μl的 CellTiter 96 aqueous one solution reagent的培養(yǎng)孔作為調(diào)零孔)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后上酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸光值(OD值)。按下式計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率(每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)：腫瘤細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100/100

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒的擴(kuò)增 倒置相差顯微鏡觀察：重組腺病毒Ad-Egr-hTrail或Ad-CMV-hTrail感染AE25 crma細(xì)胞后五日，AE25 crma細(xì)胞變圓，聚集成團(tuán)，呈現(xiàn)明顯的病理效應(yīng)，表明病毒開(kāi)始大量擴(kuò)增，此時(shí)開(kāi)始收集病毒。無(wú)病毒感染的AE25 crma細(xì)胞為多邊形，呈現(xiàn)均勻的貼壁生長(zhǎng)。

2.2 重組腺病毒的PCR鑒定 以病毒Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail DNA為模板加入引物后進(jìn)行PCR反應(yīng)，如期擴(kuò)增出1037bp的hTrail片斷，表明hTrail全長(zhǎng)被成功插入到腺病毒基因中。

2.3 兩種腺病毒重組載體及放射線對(duì) U251細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 Ad-Egr-hTrail對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單用Ad-Egr-hTrail對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率僅為5.49%，與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);但Ad-Egr-hTrail與 12 Gy-X射線聯(lián)合作用時(shí)，抑制率為40.77%，殺傷率提高了7.43倍，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3.2 Ad-CMV-hTrail對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響 單用Ad-CMV-hTrail對(duì)U251細(xì)胞的抑制率為24.61%，與單用放射治療組的抑制率(29.55%)相當(dāng)(P＞0.05)，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與12 Gy-X射線聯(lián)合作用時(shí)，抑制率為45.15%，殺傷率提高了1.84倍，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3.3 兩種腺病毒重組載體聯(lián)合放射線對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響 Ad-Egr-hTrail+照射組及Ad-CMV-hTrail+照射組對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率分別為40.77%、45.15%，二者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與單次大劑量(12 Gy)的放射治療抑制率(29.55%)相比，其放射增敏比分別為1.38、1.53倍。以上結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩種腺病毒重組載體及放射線對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

3 討論

選擇有效的目的基因是腫瘤基因-放射治療的關(guān)鍵。Trail是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族的新成員，由于其最顯著特點(diǎn)是僅誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)正常細(xì)胞則無(wú)毒性作用［1］，成為目前的研究熱點(diǎn)。Kagawa等［2］采用表達(dá)人 Trail基因的腺病毒載體，在體內(nèi)外轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及腫瘤，證明其抗腫瘤作用具有旁觀者效應(yīng)，即在被轉(zhuǎn)入Trail基因的腫瘤細(xì)胞周?chē)幢晦D(zhuǎn)入Trail基因的腫瘤細(xì)胞也出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。此外，Trail誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡不依賴(lài)p53基因是否突變，而常規(guī)放射療法在腫瘤抑制基因p53基因突變的情況下則出現(xiàn)輻射抗性。研究表明，在高達(dá)50%的高級(jí)別膠質(zhì)瘤中p53發(fā)生突變或缺失，因而在放療中發(fā)生DNA損傷的腫瘤細(xì)胞亦能存活和繁殖，且有惡性度增加的趨勢(shì)［3］。研究發(fā)現(xiàn)不僅放療能通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞DR5受體的表達(dá)而增強(qiáng)Trail治療的敏感性［4］，而且Trail亦能增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放射線和化療藥物敏感性［5，6］。因此TRAIL與放療的聯(lián)合應(yīng)用，不僅減少了單獨(dú)應(yīng)用放療的毒副作用，而且還起到互相增敏作用。

轉(zhuǎn)移基因的體內(nèi)表達(dá)調(diào)控是基因治療的關(guān)鍵技術(shù)之一，目前在腫瘤基因治療中往往采用啟動(dòng)子調(diào)控體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)，所用的啟動(dòng)子分三類(lèi)：第一類(lèi)能夠強(qiáng)而持久的驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)(如 CMV);第二類(lèi)有組織或腫瘤特異性(如AFP);第三類(lèi)活性受控于誘導(dǎo)劑或阻遏劑。Egr-1啟動(dòng)子屬于第三種，它與一般組織特異啟動(dòng)子誘導(dǎo)持續(xù)基因表達(dá)不同，Egr-1啟動(dòng)子受到輻射誘導(dǎo)后的表達(dá)為超強(qiáng)性，當(dāng)輻射反應(yīng)結(jié)束后隨之減弱或終止［7］。Egr-1基因啟動(dòng)子序列中的放射敏感性CArG盒可感受體內(nèi)外理化刺激如自由基、電離輻射等，誘導(dǎo)Egr-1基因表達(dá)，從而對(duì)與之相連的外源基因?qū)崿F(xiàn)雙向性調(diào)控作用［8］。國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究報(bào)道較少。

我們利用Ad-Egr-hTrail感染U251細(xì)胞，在以Ad-CMV-hTrail感染作為對(duì)照的基礎(chǔ)上，聯(lián)合放射治療，發(fā)現(xiàn)：①單純Ad-Egr-hTrail對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率僅為5.49%，與對(duì)照組無(wú)明顯差別，但當(dāng)給與12 Gy-X的照射后，對(duì)腫瘤的抑制率高達(dá)40.77%，提高了7.43倍，說(shuō)明Ad-Egr-hTrail具有較強(qiáng)的輻射誘導(dǎo)特性。Egr-1啟動(dòng)子在感受電離輻射刺激后，的確可以誘導(dǎo)人TRAIL基因的表達(dá)，提高TRAIL基因的抗腫瘤作用。Staba等［9］Ad-Egr-TNFα轉(zhuǎn)染人惡性膠質(zhì)瘤D54的裸鼠模型，聯(lián)合輻射也得出類(lèi)似的結(jié)果。②單純Ad-CMV-hTrail對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率為24.61%，與單純大劑量輻射(12 Gy)的抗腫瘤效應(yīng)(29.55%)相當(dāng)。說(shuō)明CMV是一種強(qiáng)而持久的啟動(dòng)子，其誘導(dǎo)下游基因Trail表達(dá)的抗腫瘤作用可以近似達(dá)到單次大劑量輻射的效應(yīng)。當(dāng)兩者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)腫瘤的抑制率增加到45.15%，僅提高了1.84倍，說(shuō)明放射治療可增加Ad-CMV-hTrail對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，但CMV啟動(dòng)子無(wú)明顯的輻射誘導(dǎo)特性。③Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail兩種腺病毒重組載體聯(lián)合放射線對(duì)U251細(xì)胞抑制率明顯高于單獨(dú)放射治療組(29.55%)，其放射增敏比分別為1.38、1.53倍，說(shuō)明人Trail基因具有輻射增敏作用。

本研究的特色在于把抗腫瘤基因的最新研究成果與輻射研究結(jié)合起來(lái)，將人Trail基因置于輻射誘導(dǎo)性啟動(dòng)子Egr-1調(diào)控之下，通過(guò)輻射誘導(dǎo)人Trail基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控，解決了基因治療中目的基因表達(dá)難控制的問(wèn)題。一方面，輻射作為誘導(dǎo)劑自身不僅具有抗腫瘤作用，而且能提高基因靶向轉(zhuǎn)移的效率，相對(duì)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)時(shí)間［10］。另一方面，具有輻射增敏作用的基因表達(dá)產(chǎn)物由于輻射的靶向性而局限于腫瘤局部，既發(fā)揮了對(duì)腫瘤的治療作用，又使其系統(tǒng)毒性最小化。因此將輻射與攜帶治療基因的輻射誘導(dǎo)表達(dá)載體聯(lián)合治療惡性腫瘤，將會(huì)發(fā)揮更加理想的療效。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了采用放射誘導(dǎo)的啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)目的基因的表達(dá)是切實(shí)可行的有效的基因治療方法。

［1］Choi C，Kutsch O，Park J，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand induces caspase-dependent interleukin-8 expression and apoptosis in human astroglioma cells.Mol Cell Biol，2002，22(3)：724-736．

［2］Kagawa S，He C，Gu J，et al.Antitumor activity and bystander efects of the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)gene.Cancer Res，2001，61(8)：3330-3338．

［3］Polack IF，Hamilton RL，F(xiàn)inkelstein SD，et al.The relationship between TP53 mutations and overpression of p53 and progress in malignant gliomas of childhood.Cancer Res，1997，57：304-309．

［4］Hamasu T，Inanami O，Asanuma T，et al.Enhanced induction of apoptosis by combined treatment of human carcinoma cells with X rays and death receptor agonists.Radiat Res(Tokyo)，2005，46(1)：103-110．

［5］Tsurushima H，Yuan X，Dillehay LE，et al.Radioresponsive tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)gene therapy for malignant brain tumors.Cancer Gene Ther，2007，14(8)：706-716．

［6］Hori T，Kondo T，Kanamori M，et al.Ionizing radiation enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced apoptosis through up-regulations of death receptor 4(DR4)and death receptor 5(DR5)in human osteosarcoma cells.J Orthop Res，2010，28(6)：739-745．

［7］Scott SD，Marples B，Hendry JH，et al.A radiation-controlled molecular switch for use in gene therapy of cancer．Gene Ther，2000，7：1121-1125．

［8］Papanikolaou NA，Sabban EL.Ability of Egr-1 to activate tyro-sine hydroxylase transcription in PC12 cells. Cross-talk with AP-1factors.Jbiol Chem，2000，275(35)：26683-26689．

［9］Staba MJ，Mauceri HJ，Kufe DW，et al.Adenoviral TNF-alpha gene therapy and radiation damage tumor vasculature in a human malignant glioma xenograft．Gene Ther，1998，5(3)：293-300．

［10］Zeng M，Cerniglia GJ，Eck，SL.Stevens CW.High-efficiency stable gene transfer of adenovirus into mammalian cells using ionizing radiation.Hum Gene Ther，1997，8(9)：1025-1032．