茵連痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李新液，徐玲玲，徐 熠，年 華（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海市 200437）

茵連痛風(fēng)顆粒為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的自制復(fù)方制劑，由茵陳、連錢草、伸筋草組成，具有清熱、利濕、通絡(luò)的功效。用于治療慢性痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎，幾十年的臨床應(yīng)用顯示，療效顯著。處方中所含綠原酸、阿魏酸等成分對(duì)慢性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療效果[1]。為了有效控制該制劑的品質(zhì)，有必要對(duì)茵連痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討。故本試驗(yàn)采用薄層色譜（TLC）法對(duì)組成藥物進(jìn)行定性鑒別；采用紫外分光光度法對(duì)處方中的主要成分總香豆素和總黃酮的含量進(jìn)行測定，以期能有效控制制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；80-1離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；BransonB5200S-DT超聲提取器（必能信超聲（上海）有限公司）；HHS電熱數(shù)字顯示恒溫水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）。

蘆丁、阿魏酸、濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品和連線草、茵陳對(duì)照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為0080-9705、0773-9910、1511-200001、121109-200401、950-200204）；茵陳、連錢草、伸筋草藥材均購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆缮虾Ｖ兴庂|(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)室葉愈青副主任藥師鑒定為真品；茵連痛風(fēng)顆粒（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科制 劑 室 ，批 號(hào) ：081001、081101、090722、090901、091001、091101、100401、100501、100601）；三氯化鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、甲醇、乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 茵陳的TLC鑒別 取茵連痛風(fēng)顆粒10 g，研細(xì)，加乙醇20 mL，水浴加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用醋酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；將除茵陳外的所有藥材按處方比例制成陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取茵陳對(duì)照藥材5 g，加水50 mL，煎煮1 h，放冷，濾過，濾液用醋酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。茵陳的TLC見圖1。

2.1.2 連錢草的TLC鑒別 取本品粉末5 g，加70%甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)檬兔眩?0～60℃）5 mL浸漬3 min，棄去石油醚，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取不含連錢草的各處方藥材，按組方比例制成陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取連錢草對(duì)照藥材2.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶9∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，于105℃加熱數(shù)分鐘，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。連錢草的TLC見圖2。

圖1 茵陳的TLC1.茵陳對(duì)照藥材；2～4.供試品（批號(hào)：100401、100501、100601）；5.缺茵陳陰性樣品Fig1 TLC of Artemisiae Scopariae Herba1.Artemisiae Scopariae Herba reference substance；2～4.test samples （batch number： 100401，100501，100601）；5.negative sample without Artemisiae Scopariae Herba

圖2 連錢草的TLC1.連錢草對(duì)照藥材；2～4.供試品（批號(hào)：100401、100501、100601）；5.缺連錢草陰性樣品Fig2 TLC of Glechoma longituba1.Glechomae Herba reference substance；2～4.test samples（batch number：100401，100501，100601）；5.negative sample without G.longituba

2.1.3 伸筋草的TLC鑒別 取茵連痛風(fēng)顆粒3 g，加10 mL蒸餾水使溶解，用醋酸乙酯-甲酸（9.5∶0.5）振搖提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取缺伸筋草的所有藥材按處方比例制成陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；另取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。伸筋草的TLC見圖3。

2.2 總香豆素的含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取茵連痛風(fēng)顆粒2.5 g，加70%乙醇15 mL，回流提取0.5 h，濾過，靜置2 h，取上清液1 mL，稀釋125倍，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 mL含0.067 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 測定波長的考察 取濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，于200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果對(duì)照品和供試品溶液均在345 nm波長左右有最大吸收，且相互無干擾，故選用345 nm作為檢測波長。紫外吸收光譜見圖4。

圖3 伸筋草的TLC1.阿魏酸對(duì)照品；2～4.供試品（批號(hào)：100401、100501、100601）；5.缺伸筋草陰性樣品Fig3 TLC of Lycopodium japonicum1.ferulic acid control；2～4.test samples（batch number：100401，100501，100601）；5.negative sample without L.japonicum

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。以70%乙醇作為空白對(duì)照。以濱蒿內(nèi)酯檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.058X－0.002（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，濱蒿內(nèi)酯檢測濃度在2.68～21.44 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，分別于0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h測定吸光度。結(jié)果，RSD＝1.14%（n＝6），表明在4 h內(nèi)供試品溶液較穩(wěn)定。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，在345 nm波長處重復(fù)測定6次。結(jié)果，RSD＝0.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茵連痛風(fēng)顆粒適量，研細(xì)，取6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在345 nm波長處測定吸光度。結(jié)果，RSD＝1.61%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品適量，共9份，精密稱定，各精密加入樣品含量80%、100%、120%的濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制備，分別測定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

圖4 紫外吸收光譜（Ⅰ）1.濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品；2.茵連痛風(fēng)顆粒Fig4 UV absorbance spectrum（Ⅰ）1.escoparone control；2.Yinlian tongfeng granules

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.2.9 樣品含量測定 取5批茵連痛風(fēng)顆粒適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在345 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總香豆素含量，結(jié)果見表2。

2.3 總黃酮的含量測定

2.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取茵連痛風(fēng)顆粒1 g，置三角燒瓶中，加20 mL水溶解，加入95%乙醇34 mL，靜置2 h，離心，取上清液，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.40 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，超聲20 min使其溶解，放冷，加甲醇至刻度，即得。

表2 總香豆素的含量測定結(jié)果（n＝3）Tab2 Results of content determination of total coumarin（n＝3）

2.3.3 測定波長的考察 取蘆丁對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，于200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果，對(duì)照品和供試品溶液均在513 nm波長左右有最大吸收，且相互無干擾，故選用513 nm作為檢測波長。紫外吸收光譜見圖5。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置20 mL容量瓶中，分別加 6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0 mL蒸餾水，再各加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min后加三氯化鋁試液1 mL，放 置 6 min，再 加10%氫氧化鈉溶液10 mL，定容，放置15 min，以第一管作為空白組，在513 nm波長處測定吸光度。以蘆丁檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝0.008 791X+0.005 8（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，蘆丁檢測濃度在10～60 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液適量，按“2.3.4”項(xiàng)下方法，顯色15 min后每隔5 min測定其吸光度。結(jié)果，RSD＝0.47%（n＝8），表明顯色后在45 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液4.0 mL，按“2.3.4”項(xiàng)下方法操作并重復(fù)測定5次。結(jié)果，平均吸光度為0.361，RSD＝0.58%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批次茵連痛風(fēng)顆粒適量，共6份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.3.4”項(xiàng)下方法操作并測定吸光度。結(jié)果，RSD＝0.38%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的茵連痛風(fēng)顆粒樣品適量，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取9份供試品溶液1 mL，置20 mL容量瓶中，分別加入高、中、低濃度的蘆丁對(duì)照品溶液各3份，照“2.3.4”項(xiàng)下方法測定吸光度，并測定加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.3.9 樣品含量測定 精密稱取不同批次的茵連痛風(fēng)顆粒適量，共5份，精密稱定，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.3.4”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表4。

圖5 紫外吸收光譜（Ⅱ）1.蘆丁對(duì)照品；2.茵連痛風(fēng)顆粒（顯色）；3.茵連痛風(fēng)顆粒（未顯色）Fig5 UV absorbance spectrum（Ⅱ）1.rutin control；2.Yinlian tongfeng granules（coloration）；3.Yinlian tongfeng granules（non-coloration）

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab3 Results of recovery tests（n＝9）

表4 總黃酮含量測定結(jié)果（n＝3）Tab4 Results of content determination of total flavonoids（n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)采用專屬性較強(qiáng)的TLC法對(duì)處方各藥味進(jìn)行定性鑒別，采用紫外分光光度法對(duì)主要成分進(jìn)行含量測定，可以有效地保證該制劑用藥的有效性及可靠性。

方中總香豆素具有一定的利尿抗炎[3]、抗氧化[4]的作用；黃酮類成分具有抗菌、抗炎、抗肝臟毒性、降壓等生物活性[5，6]。故對(duì)其進(jìn)行含量測定，可以快速、簡便、有效地對(duì)痛風(fēng)顆粒中的抗炎成分進(jìn)行質(zhì)量控制，從而保證制劑療效，達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

在總香豆素含量測定試驗(yàn)中，分別考察了30%、50%、70%和95%乙醇含量對(duì)試驗(yàn)的影響。結(jié)果顯示，70%乙醇的提取效果較優(yōu)。再對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，0.5 h的回流時(shí)間提取的總香豆素含量較高。

在總黃酮含量測定試驗(yàn)中，曾對(duì)顯色劑中的氫氧化鈉加入量進(jìn)行考察。結(jié)果表明，加入10 mL氫氧化鈉溶液進(jìn)行顯色的效果較好，且在45 min內(nèi)具有良好的顯色效果。茵連痛風(fēng)顆粒不同批次間的最高和最低含量相差倍數(shù)為2.07倍，故建議在控制制劑質(zhì)量時(shí)，測定其投料總黃酮含量。

[1]徐 熠，徐玲玲.中醫(yī)藥治療痛風(fēng)的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2010，21（23）：2 195.

[2]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34.

[3]中華本草編委會(huì).中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：6 732-6 733.

[4]王 倩，王 豐，薛 松，等.茵陳中7-甲氧基香豆素的分離與含量測定[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20（1）：12.

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