美寶濕潤(rùn)燒傷膏對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的保護(hù)作用研究

張莉，高志軍，趙靜（.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，拉薩市850000；.西藏當(dāng)雄縣人民醫(yī)院，當(dāng)雄縣85500）

嚴(yán)重?zé)隣C傷早期因腸黏膜屏障功能受損會(huì)導(dǎo)致腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，激活炎癥以及后續(xù)的代償性抗炎反應(yīng)和免疫系統(tǒng)自我保護(hù)作用，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡，從而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（Multiple Organs Dysfunction syndrome，MODS）。國(guó)外研究證實(shí)，大鼠Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路及下游相關(guān)的效應(yīng)分子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）參與了燒傷后炎癥的發(fā)生[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，作為TLR4的配體脂多糖（LPS）也在燒傷后續(xù)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[2，3]。

美寶濕潤(rùn)燒傷膏（MEBO）主要成分包括黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼，具有清熱、解毒、止痛、生肌功效，廣泛用于治療各種燒、燙、灼傷。在本研究中，筆者將MEBO運(yùn)用于燙傷大鼠，觀察其對(duì)燙傷大鼠創(chuàng)面愈合和TLR4/LPS信號(hào)通路及TNF-α、IL-6的影響，初步闡明其對(duì)燙傷后炎癥的相關(guān)作用機(jī)制，為燒燙傷創(chuàng)面愈合的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；680型全波長(zhǎng)酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；721型分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；內(nèi)毒素檢測(cè)試劑（鱟試劑）動(dòng)態(tài)檢測(cè)儀（北京時(shí)代新光生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

MEBO（汕頭市美寶制藥有限公司，批號(hào)：Z20000004）；鱟試劑（上海坤肯生物化工有限公司）；PE標(biāo)記的大鼠TLR4單克隆抗體、FITC標(biāo)記的鼠免疫球蛋白G（IgG）均購(gòu)自美國(guó)BD公司；紅細(xì)胞裂解液、TNF-α、IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒（深圳晶美生物技術(shù)公司）。

1.3 動(dòng)物

大鼠30只，♂，體重280～320 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：24301050）。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制和分組、給藥

將30只SD大鼠隨機(jī)均分為空白對(duì)照、模型對(duì)照和MEBO組。除空白對(duì)照組外，其它大鼠在清醒狀態(tài)下，以200 g·L-1硫化鈉背部脫毛；200 g·L-1的烏拉坦溶液按5 mL·kg-1ip麻醉，置電熱恒浴中致背部燙傷（108℃，8 s），復(fù)制深Ⅱ度（經(jīng)病理證實(shí)）燙傷模型，燙傷后ip生理鹽水（40 mL·kg-1）抗休克。創(chuàng)面處理方式：模型對(duì)照組大鼠燙傷后讓創(chuàng)面暴露；MEBO組大鼠燙傷后涂MEBO于創(chuàng)面（厚度薄于1 mm），每8 h更換新藥。注意換藥前需將殘留在創(chuàng)面上的藥物及液化物拭去，同時(shí)暴露創(chuàng)面。燙傷后大鼠分籠飼養(yǎng)。觀察期間未發(fā)生明顯感染癥狀。

2.2 標(biāo)本收集

將空白對(duì)照和MEBO組大鼠在燙傷后各時(shí)相點(diǎn)麻醉，無(wú)菌條件下經(jīng)尾靜脈采集靜脈血，一部分置于去熱源肝素化試管中，3 000 r·min-1、4℃下收集血漿；一部分置于去內(nèi)毒素的干凈試管中自凝，3 000 r·min-1、4℃下收集血清。樣本于－70℃貯藏，備用。

2.3 大鼠創(chuàng)面愈合情況觀察

每日觀察傷口愈合情況，以創(chuàng)面完全上皮化、無(wú)滲出作為創(chuàng)面完全愈合依據(jù)，同時(shí)記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間；按Nagelschmidt法[6]計(jì)算各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面愈合率：用透明稱量紙（7.5 cm×7.5 cm，平均重量約為0.156 8 g）覆蓋于大鼠背部創(chuàng)面，將創(chuàng)面邊緣清晰描繪在透明稱量紙上，僅保留曲線繪制所圍的面積并稱重。創(chuàng)面面積＝（7.5 cm×7.5 cm×紙片重）/0.156 8 g；創(chuàng)面愈合率/%＝（原始創(chuàng)面面積－未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.4 LPS檢測(cè)

參考鱟試劑檢測(cè)說(shuō)明書(shū)，采用濁度法（內(nèi)毒素檢測(cè)法）檢測(cè)各組大鼠血漿中內(nèi)毒素含量。其原理是當(dāng)被檢測(cè)的樣品中含有內(nèi)毒素時(shí)，鱟試劑會(huì)變混濁。內(nèi)毒素含量與混濁程度呈正比，可準(zhǔn)確量化被檢測(cè)樣品中內(nèi)毒素的含量。顯色后采用分光光度計(jì)于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得大鼠血漿中LPS含量。

2.5 ELISA檢測(cè)

采用ELISA檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

抽取EDTA抗凝靜脈血2 mL，采用細(xì)胞分離柱方法進(jìn)行，在無(wú)菌情況下采用淋巴細(xì)胞分離液方法分離淋巴細(xì)胞，熒光抗體標(biāo)記的淋巴細(xì)胞懸液4℃條件下避光孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。取1×106個(gè)·mL-1細(xì)胞標(biāo)記的抗TLR4-PE單克隆抗體和抗FITC-IgG單克隆抗體，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量資料均采用±s表示；TNF-α含量、IL-6含量用χ2檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；LPS含量用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間及不同時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面愈合率

相對(duì)于模型對(duì)照組[（22.83±2.82）d]，MEBO組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間[（17.25±1.78）d]顯著縮短（P＜0.01）。各組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間（±s，n＝10）Tab1 Healing time of wound in each grou（±s，n＝10）

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間（±s，n＝10）Tab1 Healing time of wound in each grou（±s，n＝10）

與模型對(duì)照組比較：＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.01

創(chuàng)面愈合時(shí)間/d 22.83±2.82 17.25±1.78＊組別模型對(duì)照組MEBO組

在傷后的前3天，MEBO組大鼠與模型對(duì)照組比較，創(chuàng)面愈合率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；從第7天至第21天，MEBO可明顯促進(jìn)燙傷大鼠的創(chuàng)面愈合（P＜0.01或P＜0.05）。不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面愈合率見(jiàn)表2。

3.2 各組大鼠血漿中LPS含量變化

表2 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面愈合率（±s，n＝10）Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point（±s，n＝10）

表2 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面愈合率（±s，n＝10）Tab2 Healing rate of wound in each group at different time point（±s，n＝10）

與模型對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對(duì)照組MEBO組不同時(shí)相點(diǎn)的愈合率/%28 d 100 100 1 d 2.03±0.32 1.98±0.30 3 d 10.69±2.32 11.84±3.89 7 d 36.87±6.25 41.88±8.03＊14 d 70.56±12.20 85.46±13.74＊＊21 d 92.07±14.64 100＊＊

傷后第1天至第7天，模型對(duì)照組大鼠血漿中LPS含量逐漸升高，于第7天達(dá)到頂峰后逐漸降低；與模型對(duì)照組比較，從第7天至第21天，不同時(shí)相點(diǎn)MEBO可顯著降低燙傷大鼠血漿中LPS含量（P＜0.01或P＜0.05）。不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血漿LPS含量變化見(jiàn)表3。

3.3 傷后各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量變化

表3 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血漿LPS含量變化（±s，n＝10）Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表3 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血漿LPS含量變化（±s，n＝10）Tab3 The content of LPS in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對(duì)照組MEBO組不同時(shí)相點(diǎn)的LPS含量/μg·mL-1 28 d 0.73±0.17 0.69±0.18 1 d 0.70±0.11 0.73±0.10 3 d 0.72±0.14 0.69±0.12 7 d 1.23±0.34 0.91±0.26＊＊14 d 0.98±0.22 0.76±0.19＊＊21 d 0.85±0.18 0.71±0.16＊

第1天至第28天，模型對(duì)照組大鼠血清中TNF-α的水平逐漸降低；與模型對(duì)照組比較，從第7天至第28天，MEBO可有效降低燙傷模型大鼠血漿中TNF-α含量（P＜0.01或P＜0.05）。不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血清TNF-α含量變化見(jiàn)表4。

表4 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血清TNF-α含量變化（±s，n＝10）Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表4 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血清TNF-α含量變化（±s，n＝10）Tab 4The content of TNF-α in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

模型對(duì)照組MEBO組0.56±0.19 0.43±0.13＊＊1.38±0.35 1.43±0.38 0.98±0.27 0.93±0.26 0.78±0.18 0.61±0.20＊0.70±0.22 0.58±0.18＊0.63±0.21 0.51±0.16＊＊

模型對(duì)照組大鼠血清中IL-6于第3天達(dá)到最高峰，隨后緩慢下降；經(jīng)MEBO處理后，大鼠血清中IL-6的表達(dá)水平于第7天開(kāi)始顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血清IL-6含量變化見(jiàn)表5。

表5 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血清IL-6含量變化（±s，n＝10）Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points（±s，n＝10）

表5 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血清IL-6含量變化（±s，n＝10）Tab5 The content of IL-6 in rat plasma at different time points（±s，n＝10）

與模型對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

模型對(duì)照組MEBO組110.00±21.44 108.41±21.96 105.33±20.63 104.01±21.63 143.45±23.26 145.54±22.90 135.69±21.77 128.95±20.10＊123.33±20.47 117.63±19.92＊118.88±20.85 109.79±18.64＊＊

3.4 各組大鼠外周血中TLR4百分率變化

模型對(duì)照組大鼠外周血中TLR4百分率逐漸升高，第14天達(dá)到最高峰，隨后緩慢下降；與模型對(duì)照組比較，MEBO組大鼠外周血中TLR4百分率于第7天開(kāi)始顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血漿中TLR4百分率變化見(jiàn)表6。

表6 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血漿中TLR4百分率變化（±s，n＝10）Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

表6 不同時(shí)相點(diǎn)各組大鼠血漿中TLR4百分率變化（±s，n＝10）Tab6 Percentage of TLR4 in rat plasma at different time point（±s，n＝10）

與模型對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型對(duì)照組MEBO組不同時(shí)相點(diǎn)的TLR4百分率/%1 d 1.70±0.24 1.72±0.22 3 d 2.80±0.33 2.78±0.30 7 d 5.58±0.57 4.65±0.43＊14 d 7.58±0.69 6.08±0.53＊＊21 d 5.96±0.94 5.19±0.81＊28 d 3.68±0.35 3.30±0.38

4 討論

燒、燙傷后各種炎癥細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6大量釋放，從而引發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)[4，5]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/LPS信號(hào)通路參與了燒傷后全身炎癥的發(fā)生[1]。

TLR家族是模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）中的一大類。TLR在人類進(jìn)化過(guò)程中保持高度保守的分子適應(yīng)性免疫，能識(shí)別細(xì)菌、真菌、病毒，還包括瘧原蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)[6]。這種受體最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，對(duì)果蠅的天然免疫起重要作用，后來(lái)在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了這類Toll受體，它們參與、介導(dǎo)了LPS等相關(guān)分子模式誘發(fā)的先天免疫，目前已發(fā)現(xiàn)的TLR有13種（TLR1-13）[7]。

TLR4是第一個(gè)被鑒定的人類Toll樣受體，是機(jī)體識(shí)別細(xì)菌LPS的模式識(shí)別受體。TLR4與LPS相互作用的機(jī)制目前認(rèn)為：LPS與單個(gè)核細(xì)胞膜上的脂多糖結(jié)合蛋白（LPS binding protein，LBP）結(jié)合；同時(shí)，Toll/IL-1受體家族胞漿區(qū)的接合蛋白——髓樣分化蛋白（Myeloid ifferentiation protein 88，MyD88）分子通過(guò)與TLR的相互作用形成復(fù)合物，再通過(guò)MyD88分子中的死亡結(jié)構(gòu)域的同嗜作用募集IRAK（IL-1 receptor-associated kinase）與腫瘤壞死因子相關(guān)因子TRAT6（Tummor necrosis factor-associated factor 6）等信號(hào)途徑，激活核因子-κB（NF-κB），活化AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子、黏附分子和炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響免疫與炎癥反應(yīng)[8]。

在與燒傷相關(guān)的研究中傅穎珺等[9]發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)大鼠脾臟TLR4 mRNA和蛋白水平以及早期的致炎細(xì)胞因子水平均明顯升高；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)TLR4的上調(diào)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在本研究中筆者同樣發(fā)現(xiàn)，燙傷后第14天開(kāi)始大鼠TLR4的表達(dá)水平明顯升高，其結(jié)果與王明青等[10]的研究基本一致。而經(jīng)過(guò)EMBO處理后，TLR4在燙傷大鼠外周血中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯下調(diào)。

MEBO作為一種有效的燒傷治療藥物，廣泛用于各種燒、燙、灼傷。本研究中，筆者以MEBO運(yùn)用于燙傷大鼠，發(fā)現(xiàn)MEBO可有效縮短燙傷創(chuàng)面愈合時(shí)間并促進(jìn)燙傷創(chuàng)面的愈合。筆者同樣觀察了燙傷大鼠血清中TLR4/LPS信號(hào)通路下游的效應(yīng)分子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，燙傷后第1天至第28天，模型對(duì)照組大鼠血清中TNF-α的水平逐漸降低，其結(jié)果與現(xiàn)有報(bào)道存在一定的差異。作為炎癥早期的致炎細(xì)胞因子，燙傷后TNF-α表達(dá)水平在24 h內(nèi)迅速升高，隨后逐漸降低。而在本研究中，由于沒(méi)有設(shè)定燙傷后更早的時(shí)相點(diǎn)，故沒(méi)有觀察到TNF-α在燙傷后24 h內(nèi)迅速上升的趨勢(shì)。IL-6作為炎癥中晚期出現(xiàn)上升趨勢(shì)的細(xì)胞因子，筆者觀察到燙傷后第3天IL-6升到最高峰，隨后緩慢下降。而經(jīng)過(guò)MEBO處理后，與模型對(duì)照組比較，大鼠血清中TNF-α和IL-6的水平明顯降低，提示MEBO具有對(duì)TNF-α和IL-6的有效抑制效應(yīng)。

在本研究中，筆者證實(shí)了MEBO對(duì)于燙傷創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用，初步闡明了其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/LPS信號(hào)通路及下游的致炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)有關(guān)。但是，MEBO是如何調(diào)控TLR4/LPS信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)分子從而促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合的，需要進(jìn)一步研究。

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