米曲霉A-1固體發(fā)酵產(chǎn)胞外高活性植酸酶工藝研究

覃擁靈 何海燕

磷是動物體必需的常量元素，攝取不足會導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能下降、酸堿失衡，嚴(yán)重者易患骨質(zhì)疏松癥或佝僂病。飼料是動物體磷的主要來源，植物是飼料的主要來源，植物中的磷大部分（60%～70%）以植酸磷的形式存在[1]。飼料中的磷可分為無機磷和有機磷，其中有機磷是以植酸磷的形式存在。植酸[6-磷酸肌醇,myo-inositol(1,2,3,4,5,6)hexakis phosphate]，常存在于種子、谷物、胚芽、米糠中。植酸不以單獨的游離態(tài)存在，與一些礦物元素鈣、鎂或鉀的復(fù)鹽（如肌醇六磷酸鈣鎂）和蛋白質(zhì)以絡(luò)合物形態(tài)廣泛存在于植物中。因為其強螯合能力，影響其螯合的金屬及蛋白質(zhì)的吸收，被認(rèn)為是抗?fàn)I養(yǎng)因子（anti-nutritive factor）[2-3]。

植酸酶 （Phytases，myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase;EC 3.1.3.8和EC 3.1.3.26)，即肌醇六磷酸水解酶,是催化植酸及其植酸鹽水解成肌醇與磷酸（或磷酸鹽）一類酶的總稱[1,4-5]。植酸的利用率因動物種類的不同而不同，反芻動物瘤胃中的微生物能產(chǎn)生植酸酶，對植酸磷的利用率比較高，成年反芻動物可高達(dá)90%[4]。單胃動物消化道中只有很少的植酸酶，且活性很低，所以不能很好地利用飼料中的植酸磷，使得植酸磷隨糞便排入環(huán)境，既浪費資源，又污染環(huán)境。在飼料中添加植酸酶不僅可以解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高動物對飼料的利用率，還可以減少無機磷在飼料中的添加量，從而減少單胃動物對無機磷和植酸磷的排除量，最終減少磷對環(huán)境的污染[4-5]。植酸酶的主要來源于動物、植物和微生物，但是動物、植物中植酸酶活性很低，穩(wěn)定性也比微生物來源的植酸酶差，因此目前研究都集中于微生物植酸酶[4]。

前期試驗通過紫外誘變后得到一株酶活高遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良的高產(chǎn)植酸酶菌種——米曲霉(Aspergillus oryzae)A-1菌株，在飼料工業(yè)上有潛在應(yīng)用價值[6]。本課題利用本地來源充足、價格低廉的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品桑桿、蔗渣、棉籽殼、板栗殼作為培養(yǎng)基碳源開展固體發(fā)酵產(chǎn)植酸酶條件優(yōu)化研究，同時研究表面活性劑誘導(dǎo)產(chǎn)胞外酶及酶提取工藝，提高固體發(fā)酵產(chǎn)植酸酶得率。

1 材料與方法

1.1 菌種

實驗室選育的米曲霉(Asper gillusoryzae)A-1菌株[6]。

1.2 PDA斜面培養(yǎng)基

依照諸葛健(1994)[7]的方法配制。

1.3 菌種活化及種子培養(yǎng)

取已經(jīng)活化的米曲霉A-1新鮮斜面種，在無菌超凈工作臺中將斜面種用生理鹽水洗下制成孢子液，利用生理鹽水配制成孢子含量為1×107個/ml的孢子液，取100 ml的孢子液置于250 ml三角瓶中，160 r/min恒溫?fù)u床30℃振蕩培養(yǎng)12h，使孢子處于預(yù)萌發(fā)狀態(tài)，備用接種。

1.4 固體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基

①桑桿固體發(fā)酵培養(yǎng)基：6 g粉碎的桑桿、4 g麩皮；②蔗渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基：6 g蔗渣、4 g麩皮；③板栗殼渣固體發(fā)酵培養(yǎng)基:6 g粉碎的板栗殼渣、4 g麩皮；④棉籽殼固體發(fā)酵培養(yǎng)基:6 g天然棉籽殼、4 g麩皮。

營養(yǎng)鹽液：5 g NH4NO3、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4·7H2O、0.3 g MnSO4·7H2O、0.3 g FeSO4·7H2O、0.2 g NaCl、0.5 g NH4Cl，溶于 1 000 ml蒸餾水中。

所有固體培養(yǎng)基材料均粉碎至100目(篩孔尺寸0.150 mm)，以上4種固體發(fā)酵培養(yǎng)基均各加入30 ml營養(yǎng)鹽液于250 ml錐形瓶中，自然pH值，121℃滅菌20 min。

1.5 不同時間固體發(fā)酵產(chǎn)酶及酶液的提取

取107個孢子轉(zhuǎn)入4種固體發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)3～6 d后提取酶液。按10：1（v/m）加入dd H2O,40℃、200 r/min恒溫?fù)u床2 h，8層紗布過濾，4℃、5 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液[8]。粗酶液4℃冰箱中保存，待測酶活時用。

3次平行試驗，取平均值。

1.6 不同溫度產(chǎn)酶研究

取米曲霉A-1菌株107個孢子轉(zhuǎn)入4種固體發(fā)酵產(chǎn)植酸酶培養(yǎng)基中，將已接種的固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基統(tǒng)一放到恒溫培養(yǎng)箱中，30～50℃，每隔5℃一個梯度，培養(yǎng)適宜時間后提取酶液。

1.7 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)植酸酶的影響

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為3～6，考察培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)植酸酶的影響。

1.8 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

以營養(yǎng)鹽液中的不同氮源培養(yǎng)米曲霉：NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、花生餅粉、黃豆餅粉、蛋白胨，試驗方法同1.5。

1.9 表面活性劑對產(chǎn)酶的影響

固體培養(yǎng)基中添加0.2%～0.7%吐溫80，研究表面活性劑吐溫80對產(chǎn)酶的影響[9-10]。

1.10 酶液的提取優(yōu)化

參照1.5提取法，添加2%不同鹽液[9]：CaCl2·2H2O、CaCO3、CaSO4·2H2O、KCl，優(yōu)化酶液提取工藝。

1.11 植酸酶的酶活檢測方法[11-13]

采用2009年制定的中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)：飼用植酸酶活性的測定——分光光度法進(jìn)行測定，酶活力單位定義：樣品在植酸鈉濃度為 5.0 mmol/l，溫度37℃，pH值5.5的條件下,每分鐘從植酸鈉中釋放出1 μmol無機磷,即為1個酶活單位,以 U表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固體碳源及不同時間產(chǎn)植酸酶研究

向4種固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中接入米曲霉孢子懸液1 ml(107個孢子)，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d按照以上的酶液提取方法定期取出一定量酶液，測其酶活(見表1)。試驗結(jié)果表明，第4 d所產(chǎn)的植酸酶酶活最高，推測米曲霉產(chǎn)植酸酶應(yīng)該為與生長無相關(guān)型發(fā)酵，產(chǎn)物在菌種生長穩(wěn)定期合成，時間過長營養(yǎng)供應(yīng)不足，菌體死亡后自溶活性降低，最適發(fā)酵時間為4 d。

試驗結(jié)果表明，桑桿、蔗渣、板栗殼、天然棉籽殼均可以固體發(fā)酵產(chǎn)植酸酶，第4 d酶活最高，其中蔗渣為碳源的培養(yǎng)基植酸酶活性較高，活力為71.2 U/g，以下固體發(fā)酵試驗優(yōu)化選用蔗渣為碳源。

表1 固體碳源和培養(yǎng)時間對產(chǎn)植酸酶酶活的影響(U/g)

2.2 培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)植酸酶的影響(見圖1)

圖1 pH值對產(chǎn)植酸酶的影響

30℃，不同pH值培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)基最佳初始pH值產(chǎn)酶酶活最高，設(shè)該pH值條件下酶活為100%，測定不同初始pH值條件下產(chǎn)酶的相對酶活作圖。測定蔗渣天然固體培養(yǎng)基pH值為6，試驗結(jié)果顯示，pH值為4.5時，米曲霉A1菌株所產(chǎn)的植酸酶酶活最高，比天然培養(yǎng)基提高20%，達(dá)到85.4 U/g。pH值是微生物代謝的綜合反映，由試驗結(jié)果推測，pH值4.5為酶的最適pH值；pH值4.5影響米曲霉A1細(xì)胞膜所帶電荷發(fā)生改變，從而改變細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)植酸酶排出細(xì)胞外，提高整體酶活。

2.3 氮源對產(chǎn)植酸酶的影響（見圖2）

圖2 不同氮源對產(chǎn)植酸酶的影響

氯化銨等6種氮源被用于固體發(fā)酵產(chǎn)植酸酶，30℃培養(yǎng)4 d。設(shè)氯化銨為氮源時酶活為100%，以不同氮源與相對酶活作圖。由圖2可知，花生餅粉、黃豆餅粉、蛋白胨這些有機氮源產(chǎn)酶相對較低，硝酸銨可以明顯提高產(chǎn)酶能力，比氯化銨為氮源提高32%，達(dá)到112.8 U/g，以下試驗選用硝酸銨為氮源。

2.4 吐溫80對產(chǎn)胞外植酸酶的影響（見圖3）

圖3 吐溫80對產(chǎn)植酸酶的影響

Ebune等[8]認(rèn)為，吐溫80可以刺激微生物生長，合成更多植酸酶[10]，同時，吐溫80可以明顯改善細(xì)胞滲透性，誘導(dǎo)胞外植酸酶的生產(chǎn)[11]。當(dāng)吐溫80含量為培養(yǎng)基的0.5%(w/w)時，酶活比未添加吐溫80的對照組增加66%，達(dá)到187.2 U/g。

2.5 溫度對產(chǎn)植酸酶的影響（見圖4）

圖4 溫度對產(chǎn)植酸酶的影響

溫度是發(fā)酵過程一個很重要的影響因子，較高的溫度可以加速微生物體內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)過程，提高催化合成植酸酶的酶活性。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為40℃時，酶活比30℃培養(yǎng)溫度提高36%，為254.6 U/g。但過高的溫度影響微生物的生長，產(chǎn)酶能力下降。

2.6 酶液的提取優(yōu)化(見表2)

與不添加鹽液的空白對照組(H2O)相比,添加2%不同鹽液 CaCl2·2H2O、CaCO3、CaSO4·2H2O、KCl，可以提高固體發(fā)酵產(chǎn)植酸酶得率，推測這些鹽液可以改變細(xì)胞通透性，利于胞內(nèi)植酸酶排出，其中添加CaCl2·2H2O植酸酶得率最高，相對酶活比空白對照試驗增加32%，酶活達(dá)到336 U/g。

3 結(jié)論

以實驗室保存的米曲霉A1菌種為出發(fā)菌株，研究4種固體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)植酸酶,結(jié)果表明，蔗渣所產(chǎn)植酸酶活性最高，以NH4NO3為氮源，添加0.5%表面活性劑吐溫80可以誘導(dǎo)產(chǎn)胞外植酸酶，CaCl2·2H2O更利于酶的提取，40℃培養(yǎng)4d，酶活達(dá)到336U/g。

蔗渣以纖維素及半纖維素為主要成分，纖維素含量達(dá)45%～50%，半纖維素22%～30%，表皮組織的木質(zhì)素含量約占19%～23%。蔗渣的木質(zhì)素分子質(zhì)量和聚合度低，含豐富的多糖類物質(zhì)。甘蔗渣是我國甘蔗糖廠數(shù)量最大的纖維殘渣副產(chǎn)物，年產(chǎn)量約為2 200萬噸左右。蔗渣來源豐富、價格低廉[14]，簡單粉碎處理就可以作為固體碳源。本試驗對培養(yǎng)基的氮源、培養(yǎng)溫度和pH值等進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高了米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的得率和酶活，將會產(chǎn)生可觀的效益。

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