酸解法-氨基酸分析儀測定蠶蛹中的17種氨基酸

雷萍林淼

蠶蛹(Silkworm pupa)為蠶蛾科家蠶Bombyx mori L的蛹，又名小蜂、蝶元、蠶女，是繅絲工業(yè)的主要副產(chǎn)物。蠶蛹營養(yǎng)價值極高，蛋白質(zhì)占干蛹的45%～50%，脂肪占干蛹的25%～30%，其營養(yǎng)價值可以與進口優(yōu)質(zhì)魚粉相媲美，價格卻比魚粉便宜60%，是一種優(yōu)質(zhì)飼料原料，可以作為蛋白質(zhì)添加劑使用。蠶蛹蛋白質(zhì)主要為優(yōu)質(zhì)球蛋白，含有人體必需的8種氨基酸占總氨基酸含量的40%，構(gòu)成蛋白粉的氨基酸含量豐富且均衡，符合FAO/WHO模式，是一種比較理想的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，特別是賴氨酸的含量高于其他動物蛋白，是加工和精制高級食品的優(yōu)質(zhì)原料（周貞賓，2009；佳善，1996）。

但是蠶蛹具有易氧化變質(zhì)的特點，加上目前蠶蛹分離蛋白制備及深加工的技術水平參次不齊，在以蠶蛹為原料，加工開發(fā)食品、副食品及醫(yī)藥用品時，必須對原料蛹或成品進行檢測，以保證人們在使用時有益而無害。目前，只有少數(shù)幾篇文獻涉及到蠶蛹氨基酸含量的定量分析。而對于氨基酸的分析大多采用液相色譜（劉利娥等，2008）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（張紅漫等，2004；PerssonJ等，2001）、毛細管電泳（LinZ等，2008）、凱氏定氮法（羅欽等，2005）和光譜法（丁麗敏等，1999；Verma K 等，1988）等。然而，這些方法或試劑費用昂貴，或分離效率低，有些方法還不能同時測定多種氨基酸。運用氨基酸分析儀可解決上述問題，同時方法操作簡便，重現(xiàn)性好，靈敏度高。

1 實驗部分

1.1 方法原理

酸水解法是使用6 mol/l的鹽酸作酸解劑，使蠶蛹蛋白在110℃，鹽酸作用下，水解成氨基酸，再經(jīng)離子交換柱分離后與茚三酮柱后衍生再進行紫外測定（Verma K等，1988）。17種重要氨基酸中，脯氨酸在570 nm處有最大吸收峰，除脯氨酸外其他各氨基酸均在440 nm有最大吸收峰。因此，在570 nm檢測波長計算脯氨酸含量，而在440 nm檢測波長計算其它各氨基酸含量。

1.2 試劑與材料

1.2.1 試劑

酸解劑：6 mol/l鹽酸溶液（將優(yōu)級純鹽酸與水等體積混合）；液氮或干冰-乙醇(丙酮)；茚三酮溶液；流動相：參照表1。

表1 流動相梯度洗脫

除特殊說明，所用試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2.2 氨基酸混合標準儲備液

含天冬氨酸、蘇氨酸等17種常規(guī)蛋白水解液，分析用層析純氨基酸，各組分濃度C(氨基酸)=100 nmol/ml。

1.3 儀器與設備

Amino A200自動氨基酸分析儀系統(tǒng)：配有微型光度檢測器，超聲波提取器，溶劑微孔過濾器帶0.22 μm水相濾膜，渦旋振蕩器，水浴鍋，真空泵。

1.4 實驗方法

1.4.1 試樣制備

將蠶蛹烘干，在研缽中磨成粉狀，稱取0.5 g左右(精確至0.000 1 g)，置于20 ml濃縮瓶或濃縮管中，加10.00 ml酸解劑潤濕后，置液氮或干冰(丙酮)中冷凍，然后，抽真空至7 Pa(≤5×10-2mm汞柱)后封口。放入（110±1）℃恒溫干燥箱中，水解22～24 h。冷卻，混勻，開管，過濾，用移液管吸取適量的濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或濃縮器中，60℃抽真空，蒸發(fā)至干，必要時，加少許水，重復蒸干1～2次。用水將內(nèi)容物定量地轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，定容；過0.22 μm濾膜后即可上機。

1.4.2 色譜分析

色譜條件：氨基酸柱 (安米諾西斯公司生產(chǎn))；柱溫：采用程序升溫，58 ℃(0～38 min)、70 ℃(38～43 min)、75℃(43～75 min)和 58℃(75～82 min)；流動相流速：0.2 ml/min；檢測波長：440 nm/570 nm雙波長同時檢測；反應器溫度：115℃；分別取標準溶液及試樣20 μl進樣。根據(jù)保留時間及標準加入法定性，試樣峰面積與標準峰面積比較定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸的色譜分析

實驗所測定17種氨基酸標樣色譜見圖1。0～64 min圖譜顯示440 nm檢測結(jié)果，64 min后顯示第15～26 min波長570 nm檢測結(jié)果。圖1可見，17種氨基酸在選定的分離條件下可以達到很好的分離效果。

圖1 氨基酸標準譜

2.2 精密度實驗

在上述優(yōu)化條件下，將濃度均為100 nmol/ml的氨基酸混合標準溶液連續(xù)進樣9次，峰面積的相對標準偏差 (RSD)按出峰次序分別為3.1%(天冬氨酸)、2.9%(蘇氨酸)、1.7%(絲氨酸)、2.8%(谷氨酸)、3.4%(脯氨酸)、2.7%(甘氨酸)、3.1%(丙氨酸)、3.3%(胱氨酸)、3.4%(纈氨酸)、4.0%(蛋氨酸)、2.9%(異亮氨酸)、2.8%(亮氨酸)、3.3%(酪氨酸)、1.9%(苯丙氨酸)、2.2%(組氨酸)、2.9%(賴氨酸)、2.5%(精氨酸)。實驗結(jié)果表明，在上述優(yōu)化條件下本實驗方法是可行的。

2.3 方法的檢出限、線性范圍

根據(jù)以上的分離條件，對氨基酸的混合標樣進行測定，以信噪比（S/N）為3時確定各種氨基酸的檢出限；以幾種濃度（2、5、10、20、50、100 μmol/l)氨基酸的混合標樣進行測定，檢測結(jié)果建立標準曲線并確定線性范圍；在蠶蛹樣品中添加氨基酸混合標樣計算加標回收率。所得的數(shù)據(jù)見表2。由表2可以看出，該方法對17種氨基酸的檢測具有較低的檢出限、較寬的線性范圍以及較高的回收率，說明了用該方法檢測蠶蛹中的氨基酸所得到的數(shù)據(jù)是準確可靠的。

3 蠶蛹中氨基酸的測定

用所建立的方法對蠶蛹進行檢測，所得到的典型樣品圖譜見圖2，分析結(jié)果見表3。

表2 17種氨基酸的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及回收率

圖2 蠶蛹中氨基酸標準譜

表3 蠶蛹中氨基酸的分析結(jié)果(n=3)

4 結(jié)論

氨基酸是蠶蛹的重要組成成分。長期以來，由于氨基酸的特殊性，其定量技術成為深入研究的難點。本研究采用氨基酸分析儀測定蠶蛹中氨基酸，利用不同氨基酸之間的陰離子交換色譜的保留行為存在差異，從而實現(xiàn)了分離。結(jié)果顯示，所建立的方法具有較低的檢出限、較寬的線性范圍、簡便、快捷、準確度高的特點。蠶蛹中的總氨基酸含量達到40%以上，表明這些蠶蛹具有良好的營養(yǎng)價值。

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