不同嫁接方法對甜瓜枯萎病抗性的影響及其生理響應(yīng)

劉朋義，別之龍

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢，430070）

嫁接換根使甜瓜接穗不直接接觸土壤中的甜瓜枯萎病菌，對甜瓜的抗病生產(chǎn)具有重要意義，因而嫁接育苗在甜瓜生產(chǎn)中逐漸得到了推廣。在生產(chǎn)實際中發(fā)現(xiàn)嫁接苗有時也會感染枯萎病而死亡，但原因究竟是由于枯萎病生理小種分化所致，還是嫁接方法不當所導(dǎo)致，目前尚無定論。此外，近年來斷根嫁接育苗技術(shù)在甜瓜生產(chǎn)上已經(jīng)得到普及，部分生產(chǎn)者擔心斷根嫁接后砧木所發(fā)生的新根可能對枯萎病抗性弱，由此對斷根嫁接苗是否抗枯萎病提出了疑問?；谏鲜鰡栴}，本研究評價了不同嫁接方法對甜瓜枯萎病抗性的影響，分析了接種病菌后嫁接苗的生理變化，以期為甜瓜的嫁接栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試接穗為伊麗莎白甜瓜（北京蔬菜研究中心提供），砧木為德高鐵柱南瓜（德高蔬菜種苗研究所選育）。

供試甜瓜枯萎病菌菌株采自武漢市蔡甸區(qū)侏儒原種場田間的伊麗莎白甜瓜發(fā)病植株，由中國農(nóng)科院鄭州果樹所古勤生博士課題組分離和鑒定。

1.2 試驗方法

采用插接、斷根嫁接和靠接3種嫁接方法，以自根苗為對照。插接和斷根嫁接時，砧木比接穗早3 d播種；靠接時，接穗比砧木早5 d播種?？拷訒r分別在砧木子葉下1 cm（稱為靠接苗1）和2 cm（稱為靠接苗2）處進行。在甜瓜接穗子葉剛展開、砧木第一片真葉剛出現(xiàn)至半展開期間嫁接。嫁接后4 d，育苗棚嚴格密封，遮光、保濕，保持白天25℃、夜間20℃。嫁接后6 d，開始由小到大逐漸通風煉苗，逐步過渡到正常管理?？拷?5 d時，切斷甜瓜接穗的根部。

接穗長至2葉1心時，采用蘸根法用濃度為1×106個孢子/mL甜瓜枯萎病菌液進行人工接種，接種后將嫁接苗定植在營養(yǎng)杯中，每個處理接種30株，隨機排列，設(shè)3次重復(fù)[1]。接種后10 d測定病情指數(shù)、發(fā)病率，并取樣測根系活力，葉綠素含量，丙二醛（MDA）含量，相對電導(dǎo)率，POD、SOD、PAL 活力和總酚含量。

病情調(diào)查分級標準：0級：莖基部無褐變；1級：莖基部褐變；2級：莖基部1/2處褐變；3級：莖基部2/3處以上褐變；4級：莖基部到頂端所有維管束褐變，根部壞死[2]。病情指數(shù)＝100×∑（各病情等級數(shù)×該病情代表數(shù)）/（最高病情等級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）[3]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003軟件計算數(shù)據(jù)和作圖，用SAS 8.1軟件進行方差分析，并在5%水平采用Duncan's新復(fù)極差測驗進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫁接方法獲得的嫁接苗的發(fā)病情況

接種甜瓜枯萎病病菌10 d后觀察發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)自根苗發(fā)病率達到73%（表1），而嫁接苗發(fā)病率為1%～2%，自根苗的病情指數(shù)為63，嫁接苗的病情指數(shù)為0.3～0.8。由以上結(jié)果可知，嫁接能夠顯著提高甜瓜對枯萎病的抗病性，而不同嫁接方法對提高甜瓜的抗枯萎病能力并無顯著差異。

表1 采用不同嫁接方法獲得的嫁接苗的發(fā)病情況

2.2 接種后根系活力和葉綠素含量變化

在接種病菌10 d后，自根苗根系活力下降很大，達71.86%，而嫁接苗根系活力并無顯著變化（圖1），不同嫁接方法的嫁接苗根系活力差異不顯著。

接種病菌10 d后，自根苗葉片的葉綠素含量顯著降低，減少了43.20%，而嫁接苗葉片的葉綠素含量無顯著變化（圖2），所以接種后嫁接苗葉片仍能維持正常光合特性。接種甜瓜枯萎病后，嫁接苗葉綠素含量顯著高于自根苗，增加幅度在45.80%～67.71%，嫁接苗葉片維持正常葉色，而自根苗葉片褪綠、枯黃。不同嫁接方法處理下，接種甜瓜枯萎病對嫁接苗葉綠素含量無顯著影響。

2.3 接種后MDA含量和相對電導(dǎo)率變化

在接種病菌10 d后，甜瓜自根苗根和葉片中的MDA含量均顯著高于未接種病菌的植株，其中根和葉片中MDA含量分別增加了22%和52%（圖3），說明甜瓜自根苗接種甜瓜枯萎病菌后其細胞脂膜過氧化嚴重。但不同嫁接方法處理下，嫁接苗接種甜瓜枯萎病菌后根系和葉片中的MDA含量并無顯著差異，表明甜瓜枯萎病菌侵染后沒有對嫁接苗根系和葉片造成顯著的膜脂過氧化傷害。

接種甜瓜枯萎病菌10 d后，甜瓜自根苗根和葉片提取液的相對電導(dǎo)率分別增加了37.25%和68.75%（圖4），表明接種枯萎病菌后，自根苗根和葉片細胞膜透性增加。而采用不同嫁接方式生產(chǎn)的嫁接苗，接種枯萎病菌后根系和葉片提取液的相對電導(dǎo)率較未接種病菌的并無顯著差異，不同嫁接方法處理之間也無顯著差異。

圖1 不同嫁接方法對根系活力的影響

圖2 不同嫁接方法對葉綠素含量的影響

圖3 不同嫁接方法對甜瓜根和葉中MDA含量的影響

2.4 接種后SOD活性變化

從圖5中可以看出，接種甜瓜枯萎病菌10 d后，相對自身對照，甜瓜自根苗根中SOD活性增加了51.84%，葉片內(nèi)SOD活性增加了2倍多；嫁接苗根中SOD活性增加了65.60%～73.38%，葉片中增加了54.44%～101.81%。接種病菌10 d后，相對自根苗，嫁接苗根中SOD活性增加了28.74%～32.34%，而葉片中SOD活性減少了69.60%～92.99%。接種病菌10 d后，自根苗及嫁接苗的根和葉中SOD活性較自身對照均顯著提高，但不同嫁接方法間嫁接苗根和葉中SOD活性差異不顯著。

圖4 不同嫁接方法對根和葉相對電導(dǎo)率的影響

2.5 接種后POD活性變化

從圖6可以看出，接種甜瓜枯萎病菌10 d后，相對自身對照，甜瓜自根苗根中POD活性增加了23.87%，葉片增加了近5倍；嫁接苗根中POD活性增加了13.69%～14.44%，插接苗葉片中增加了67.37%。接種病菌10 d后，嫁接苗相對自根苗根中POD活性增加了23.69%～32.25%，而自根苗葉片中POD活性相對嫁接苗增加了1倍多；嫁接苗葉片中POD活性相對自身對照變化不顯著，而其根中POD活性較自身對照顯著提高，但不同嫁接方法間嫁接苗根和葉中POD活性差異不顯著。

2.6 接種后PAL活性和總酚含量變化

從圖7中可以看出，接種病菌10 d后，相對自身對照，甜瓜自根苗根中PAL活性增加了近1倍，葉片增加了26.94%；嫁接苗根中PAL活性相對自身對照增加了25.18%～34.75%。接種病菌10 d后，自根苗及嫁接苗根中PAL活性較自身對照顯著提高；嫁接苗相對自根苗根中PAL活性增加了1倍多。在接種病菌后只有自根苗葉片中PAL活性增加顯著，其他處理之間變化不顯著。不同嫁接方法間嫁接苗根和葉中PAL活性差異不顯著。

圖5 不同嫁接方法對根和葉中SOD活性的影響

圖6 不同嫁接方法對根和葉POD活性的影響

如圖8所示，接種病菌10 d后，相對自身對照，甜瓜自根苗根中總酚含量增加了77.68%，葉片增加了41.15%；嫁接苗根中總酚含量增加了22.04%～32.34%。而相對嫁接苗，自根苗根中總酚含量增加了28.15%～40.48%，葉片總酚含量增加了54.36%～76.94%。接種病菌10 d后，自根苗及嫁接苗的根中總酚含量較自身對照顯著增加，而只有自根苗葉片中總酚含量顯著增加，嫁接處理間變化不顯著，不同嫁接方法間嫁接苗根和葉中總酚含量差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同嫁接方法對甜瓜枯萎病抗性的影響

嫁接是防治枯萎病的重要措施，嫁接西瓜對枯萎病抗性明顯增強，且產(chǎn)量高，如砧木選用得當，其品質(zhì)基本不受影響[4，5]。但是陳士海等[6]發(fā)現(xiàn)日光溫室內(nèi)的嫁接黃瓜有時發(fā)病率高達30%，從而認為嫁接技術(shù)存在不足，如嫁接傷口和嫁接部位距離地面較近、黃瓜斷根不徹底等，因此提倡靠接和插接嫁接方法。孫永[7]也認為嫁接位置太低是引起嫁接黃瓜感病的原因，同時還提出大水漫灌的灌溉方式會使嫁接部位感染病菌。本試驗采用3種嫁接方法，并且在靠接方法上采用不同嫁接位置，結(jié)果嫁接苗均沒有發(fā)現(xiàn)嚴重的感病情況，并且斷根嫁接苗新生根也不會影響甜瓜對枯萎病的抗性，說明南瓜砧木能夠抵御甜瓜枯萎病菌的侵染，嫁接方法并不是甜瓜嫁接苗感染枯萎病的主要原因。甜瓜嫁接苗受枯萎病菌侵染死亡可能是因為不同地區(qū)甜瓜枯萎病菌生理小種的分化。

3.2 嫁接提高甜瓜枯萎病抗性的生理機制

從本研究可以看出，接種枯萎病病菌后，甜瓜嫁接苗根系活力依然維持正常狀態(tài)，能夠為地上部提供穩(wěn)定的營養(yǎng)，地上部葉片的葉綠素含量也維持穩(wěn)定，能夠使植物正常生長。而自根苗根系活力降低，根系嚴重受損，葉片褪綠，膜質(zhì)過氧化加劇，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起了細胞浸泡液的電導(dǎo)率增大，細胞不能維持正常生理機能，導(dǎo)致植株發(fā)生枯萎現(xiàn)象，逐漸趨于死亡。

圖8 不同嫁接方法對根和葉中總酚含量影響

植物對外界病原菌的防御體系包括其自身固有抗性和病原菌誘導(dǎo)抗性2種。其中病原菌誘導(dǎo)抗性是細胞在受病菌侵染后，通過改變自身結(jié)構(gòu)和內(nèi)部化學(xué)物質(zhì)一級結(jié)構(gòu)來改變酶活性而增強抵御病菌能力。本試驗中植株接種病菌后，根系和葉片中SOD、POD、PAL活性均升高，用以清除活性氧、催化壁中的大分子物質(zhì)交聯(lián)以加強壁的結(jié)構(gòu)或修復(fù)受損的壁，同時還產(chǎn)生酚類物質(zhì)抑制病菌。嫁接苗根中保護酶活性要高于自根苗，而葉中保護酶活性變化較小，說明嫁接苗根系在抗病中起到重要作用，而自根苗根系已經(jīng)受病菌嚴重侵害，植物組織結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，使得酶活降低。徐勝利等[8]發(fā)現(xiàn)嫁接西瓜生育中后期根系中PAL活性顯著高于自根苗，認為PAL與根系抗病關(guān)系密切。本試驗也發(fā)現(xiàn)嫁接苗根中PAL活性顯著高于自根苗，此外，嫁接苗根系中的SOD和POD活性也顯著高于自根苗。接種病菌10 d后，嫁接苗地上部酶活性變化不明顯，可能是由于病菌被限制在嫁接苗根中，地上部沒有受到病菌侵染；而自根苗地上部酶活性顯著增加，且顯著高于嫁接苗，表明自根苗根系無法阻止病菌對地上部的侵染，從而使得地上部細胞必須通過生理生化變化來抵御病菌脅迫。

酚類物質(zhì)是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，能夠抑制病原菌的擴展。本試驗中接種病菌10 d后，自根苗根系和葉片內(nèi)酚類物質(zhì)大量增加，表明植物受到病菌嚴重侵害，生成酚類物質(zhì)以抑制病菌。大量的酚類物質(zhì)也可能導(dǎo)致植物本身受到很大的傷害，雖然嫁接苗中酚類物質(zhì)也有少量增加，但不足以對植物產(chǎn)生抑制作用。

許勇等[9]對抗感不同的西瓜接種枯萎病菌后發(fā)現(xiàn)，抗病品種中的POD、PAL活性顯著高于感病品種，并且與木質(zhì)素和富含羥脯氨酸糖蛋白（HRGP）含量的變化協(xié)同，根莖部增加量大于葉片的增加量。魏岳榮等[10]發(fā)現(xiàn)香蕉的抗病品種抗枯5號根部和葉部酚類物質(zhì)的含量都顯著高于感病品種并且抗感品種的葉部酚類物質(zhì)含量均高于根部。

本試驗的結(jié)果說明，嫁接苗在枯萎病菌脅迫下能夠通過砧木根系內(nèi)在的生理變化提高嫁接苗植株對病菌的抗性，可能主要是通過抗氧化系統(tǒng)和PAL活性的提高來抵御枯萎病菌侵染后所致的膜脂過氧化傷害，維持根系和葉片的正常生理功能。

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