鵝巴氏桿菌病病原分離鑒定與中藥的篩選

馬 驛,陳欽旭,陳秀眉,陳均玉,彭金菊

(廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,廣東 湛江 524088)

鵝巴氏桿菌病是由禽多殺性巴氏桿菌引起鵝的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病。該病的傳播途徑廣泛,具有較高的死亡率以及導(dǎo)致生產(chǎn)性能低下等特點(diǎn),給養(yǎng)鵝業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,治療細(xì)菌性疾病的最常用藥物是抗生素和合成抗菌藥,但具有產(chǎn)生耐藥性、導(dǎo)致藥物殘留等缺點(diǎn)。我國傳統(tǒng)中藥除可克服前述缺點(diǎn)外,還可增強(qiáng)動(dòng)物免疫力,因此,從中藥中提取有效的活性成分,以取代部分高殘留藥物的研究尤為重要。研究表明,中藥及中藥復(fù)方對(duì)巴氏桿菌有較好的體外抑制效果[1-3]。本試驗(yàn)從湛江市某養(yǎng)鵝場采集病料,進(jìn)行病原分離鑒定,同時(shí)選取30種常用中藥,通過測定各中藥及其復(fù)方對(duì)病原菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC),篩選出能有效抑制該菌的中藥及中藥復(fù)方,以期為實(shí)際生產(chǎn)中防治禽類細(xì)菌病提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 中藥材 大黃、五味子、魚腥草等30種中藥均購自湛江市藥材市場。

1.2 菌株來源 從湛江市某養(yǎng)鵝場采集具有典型巴氏桿菌病病理變化的病死鵝的肝、肺、脾,分離培養(yǎng)細(xì)菌。巴氏桿菌(C48-3)標(biāo)準(zhǔn)菌株,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 培養(yǎng)基 各種生化培養(yǎng)基均為杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn);鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、鮮血瓊脂斜面和1%豬血清肉湯參照文獻(xiàn)進(jìn)行配制。

1.4 細(xì)菌分離純化 將肝、肺、脾等病料無菌接種于鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18～24 h,挑取單個(gè)菌落,再進(jìn)行純培養(yǎng)并鑒定。

1.5 涂片染色鏡檢 挑取上述純培養(yǎng)菌落抹片,進(jìn)行革蘭和美藍(lán)染色,鏡檢。

1.6 細(xì)菌生化試驗(yàn) 將純化好的疑似巴氏桿菌菌株分別接種到不同的生化培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24～48 h,觀察結(jié)果,同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比較。

1.7 中藥藥液的制備 稱取中藥各50 g置于燒杯內(nèi),加200 m L水,置于室溫下浸泡10～30 h后加熱煮沸30 min,連續(xù)煎煮3次,冷卻,過濾,合并煎煮液,濃縮至50 m L,使藥液含原藥材達(dá)1 g/m L,置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 單藥MIC與MBC的測定 將巴氏桿菌接種于1%豬血清營養(yǎng)肉湯中,37℃恒溫培養(yǎng)8～12 h,采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù),用肉湯稀釋至105CFU/m L,置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。采用液體試管二倍稀釋法測定各藥的MIC[4],取試管12支,于各管中加入菌液和藥液,使12支試管內(nèi)的菌液中藥物含量分別為 :200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.782、0.391、0.196、0 mg/mL 。37℃恒溫培養(yǎng),分別于24 h、48 h觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次。

培養(yǎng)24 h時(shí),若對(duì)照管細(xì)菌生長良好發(fā)生混濁,藥液管亦發(fā)生混濁,既表示細(xì)菌生長,該濃度供試藥物無抑菌作用;若藥液管清亮,表示細(xì)菌生長受到抑制,其為能夠抑制細(xì)菌生長的最大稀釋度的藥液,即為該藥物的最小抑菌濃度(MIC)。

繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,若藥液管仍清亮,將各管清亮的藥液接種于普通瓊脂平板上,培養(yǎng)8～12 h觀察,仍無細(xì)菌生長的最小藥物濃度即為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)。

1.9 復(fù)方的MIC及MBC測定 根據(jù)單藥的抑菌試驗(yàn)結(jié)果,篩選出8種對(duì)巴氏桿菌有較強(qiáng)抑菌作用的中藥作為主藥,分別與其他中藥組成復(fù)方,復(fù)方的MIC及MBC測定方法與單藥的方法相同。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

2.1.1 菌株分離培養(yǎng) 分離菌在普通培養(yǎng)基上生長貧瘠,在麥康凱培養(yǎng)基上不生長,在鮮血培養(yǎng)基上生長良好,長成淡灰白色、閃光的露珠狀小菌落,且無溶血現(xiàn)象。

2.1.2 涂片染色鏡檢 在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)分離菌為球桿狀或短桿狀,兩端鈍圓,以單個(gè)和成雙排列為主,革蘭染色陰性。涂片用美藍(lán)染色時(shí)可見典型的兩極著色。

2.1.3 分離株理化鑒定 詳細(xì)結(jié)果見表1,由生化特性鑒定結(jié)果可以看出分離菌株符合巴氏桿菌特征[5],初步確定為巴氏桿菌。

表1 疑似巴氏桿菌菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2 中藥對(duì)巴氏桿菌的體外抑制效果

2.2.1 單味中藥對(duì)巴氏桿菌的抑制作用 從表2可以看出,五倍子(MIC=3.125 mg/m L)、訶子(MIC=12.5 mg/m L)對(duì)巴氏桿菌的抑菌作用最好,其次是五味子、烏梅、山茱萸、石榴皮、夏枯草、梔子、魚腥草,其MIC均為25 mg/mL,青蒿、花椒、秦皮、虎杖、金銀花、紫草、大黃、皂角、茵陳、大青葉的MIC為 50 mg/m L,甘草、川蓮等 11種中藥的MIC≥100 mg/m L。殺菌作用以五倍子、五味子的效果較好,MBC均為 50 mg/m L,訶子、青蒿、甘草、川蓮的殺菌效果次之,其MBC均為100 mg/m L,其余24種中藥的MBC≥200 mg/mL。

2.2.2 中藥復(fù)方對(duì)巴氏桿菌的抑制作用 從表3、表4可以看出,五倍子、訶子、五味子、烏梅、山茱萸、石榴皮、梔子、虎杖與其他中藥組成復(fù)方后的抑菌和殺菌能力基本都大于或等于單藥。其中五倍子與黃芩、白芍、青蒿、皂角、連翹、大黃組成復(fù)方的 MIC均為0.196 mg/m L,MBC≤0.781 mg/m L;訶子與白芍、白頭翁、連翹、大黃、桂枝組成復(fù)方的抑菌效果明顯提高,MIC≤1.563 mg/m L,殺菌效果更是顯著提高,MBC≤1.563 mg/m L。

表2 單藥對(duì)巴氏桿菌的體外抑制 (mg/m L)

3 討論

3.1 細(xì)菌分離鑒定 通過病原分離、涂片鏡檢、生化鑒定,初步確定所分離的細(xì)菌為多殺性巴氏桿菌,試驗(yàn)結(jié)果為該鵝場進(jìn)行疾病防治奠定了病原學(xué)基礎(chǔ)。

3.2 中藥對(duì)巴氏桿菌的體外抑制效果 本試驗(yàn)采用水煎法制備中藥藥液,該方法所需設(shè)備簡單,操作簡便,可以在較短的時(shí)間內(nèi)完成大量中藥的篩選。在30種中藥中,不同藥物提取液對(duì)巴氏桿菌的抑制效果差別很大,其中五倍子、訶子、五味子、烏梅等對(duì)巴氏桿菌具有較強(qiáng)抑菌活性,這與王曉暉等報(bào)道訶子、五味子的水煎煮液對(duì)大腸桿菌、巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌3種致病菌都有明顯的抑菌作用結(jié)果一致[6]。李廣京等采用試管二倍稀釋法研究中藥提取物對(duì)巴氏桿菌的抑菌結(jié)果顯示烏梅(MIC為 1∶256)優(yōu)于大黃、秦皮(MIC均為1∶32),本試驗(yàn)中烏梅(MIC=25 mg/m L)的抑菌活性也大于大黃、秦皮(MIC均為50 mg/m L)[7]。但部分結(jié)果與資料報(bào)道的有差異,如王曉暉等采用平皿打孔法研究中藥的抑菌作用的試驗(yàn)結(jié)果表明,不同中藥對(duì)巴氏桿菌的抑制作用從強(qiáng)到弱依次為訶子＞黃芩＞大黃＞五味子＞金銀花[6],而本試驗(yàn)上述中藥對(duì)巴氏桿菌的抑制作用為訶子＞五味子＞金銀花＞大黃＞黃芩,這與所采用的試驗(yàn)方法及菌株不同有關(guān)。本試驗(yàn)中,部分中藥提取液對(duì)巴氏桿菌的抑制效果不佳,因此對(duì)于不同致病菌,應(yīng)采用具有針對(duì)性的中藥進(jìn)行治療。

表4 中藥復(fù)方對(duì)巴氏桿菌的最小殺菌濃度(MBC) (mg/m L)

與抗生素相比,中藥的抗菌活性較低,但其藥用效果是不能僅以藥物的MIC和MBC來進(jìn)行評(píng)價(jià),中藥對(duì)動(dòng)物免疫機(jī)能的影響亦為評(píng)價(jià)其防治效果的重要指標(biāo)[8-9]。中藥的MIC和MBC測定結(jié)果對(duì)指導(dǎo)臨床用藥劑量有一定的參考價(jià)值,但體外抗菌試驗(yàn)只能說明所試中藥與細(xì)菌直接接觸所產(chǎn)生的影響,而對(duì)被細(xì)菌感染患病的動(dòng)物的治療效果,必須進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)才能證實(shí);另外,天然中藥對(duì)動(dòng)物還具有一定的營養(yǎng)和整體調(diào)節(jié)作用,因此,篩選出的中藥在體內(nèi)飼喂試驗(yàn)中其藥效可能會(huì)有一定變化。

3.3 中藥復(fù)方的抑菌效果及前景展望 中藥復(fù)方抑菌試驗(yàn)的結(jié)果顯示:五倍子、訶子、五味子、烏梅、山茱萸、石榴皮、梔子、虎杖與其他中藥聯(lián)用,抑菌效果與單藥相比普遍提高,說明這些藥物之間有協(xié)同作用,在實(shí)踐中有較大的應(yīng)用價(jià)值。選擇多種具有不同藥理作用的中草藥組成中藥復(fù)方制劑,具有藥效互補(bǔ)、療效增強(qiáng),各藥的單劑量與不良作用減少的優(yōu)點(diǎn),中藥復(fù)方制劑的開發(fā)是當(dāng)前中藥研究的主流之一。在實(shí)際使用上更具有優(yōu)勢。但中藥復(fù)方的研究中,復(fù)方中藥的有效成分并非每味中藥有效成分的總和,這些成分相互作用有簡單的物理變化和復(fù)雜的化學(xué)變化(產(chǎn)生新的物質(zhì))。無論是單味藥還是聯(lián)合用藥,其抑菌的具體成分、作用方式和機(jī)理如何,仍需進(jìn)一步研究。

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