豫北地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離鑒定與耐藥性檢測(cè)

王麗榮,董永軍,劉興友,鄧廣付,趙德明

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疫病和殘留物防控河南省高校工程技術(shù)研究中心,河南 新鄉(xiāng) 453003)

副豬嗜血桿菌(Hps)是副豬嗜血桿菌病的病原菌,引起豬的漿液性、化膿性、多發(fā)性漿膜炎,影響2周齡到4月齡的豬,主要在斷奶后和保育階段發(fā)病,通常見于5～8周齡的豬,發(fā)病率一般在10%～15%,嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%。隨著我國(guó)規(guī)模化、集約化豬場(chǎng)的發(fā)展,副豬嗜血桿菌病在我國(guó)出現(xiàn)流行趨勢(shì),發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì),即使能耐過,也會(huì)造成仔豬生長(zhǎng)發(fā)育不良,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

自2009年11月以來,豫北地區(qū)幾個(gè)市多家豬場(chǎng)仔豬、育肥豬發(fā)生精神沉郁,食欲廢絕,體溫高達(dá)41℃,呼吸急促;部分病例體溫稍有升高,咳嗽,腹式呼吸,拉稀,逐漸減食,消瘦。剖檢可見豬胸腔內(nèi)、心包膜內(nèi)均有多量纖維素性滲出物;肺臟病變尤其明顯,除表面覆有大量纖維素性滲出物外,還有多處結(jié)締組織包圍的小化膿灶,全肺出血;全身淋巴結(jié)腫大,切面呈大理石花紋樣;腎、十二直腸均有出血點(diǎn),回盲口附近有扣狀潰瘍,脾臟出血性梗死;患病豬經(jīng)藥物治療效果不明顯,費(fèi)用大,豬傷亡較大。而且近一年來該病例在豫北地區(qū)發(fā)生頻繁,給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)帶來了較大的損失。

鑒于此,筆者對(duì)豫北地區(qū)幾個(gè)市多家豬場(chǎng)發(fā)生仔豬、育肥豬疑似副豬嗜血桿菌病的病例進(jìn)行了病原的分離鑒定和耐藥性測(cè)定,為臨床防治該病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 豫北地區(qū)新鄉(xiāng)市、安陽(yáng)市、焦作市、濮陽(yáng)市等多家豬場(chǎng)進(jìn)行采樣。

1.2 培養(yǎng)基 常規(guī)方法配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂后按8%加入新鮮綿羊血,按1%加入過濾除菌的0.01%NAD制成;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)固體培養(yǎng)基:常規(guī)配制TSA固體培養(yǎng)基按5%加入過濾除菌的牛血清,按1%加入過濾除菌的0.01%NAD制成。

1.3 生化試驗(yàn)試劑 氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、硝酸鹽、蔗糖、脲酶等,均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司,批號(hào):200907;新生胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司,批號(hào):200904;NAD購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,批號(hào):200906。

1.4 藥敏試紙 復(fù)方新諾明、新霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星 、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、林可霉素等試紙均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司,批號(hào):200909。

1.5 方法

1.5.1 觸片鏡檢 無菌采取病豬的心血、胸膜腔積水、心包積液、關(guān)節(jié)積液直接涂片,采取肺、肝、腎、淋巴結(jié)觸片,染色鏡檢。

1.5.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性檢查 無菌采取肺臟、胸膜、胸腹腔積水、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液和腦組織等病料,分別接種于巧克力瓊脂平板,對(duì)疑似Hps的菌落接種到TSA平板上純化培養(yǎng)。將分離的細(xì)菌分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂平板各2份(各取1份置于5%～10%CO2中培養(yǎng))。

1.5.3 V因子需要試驗(yàn) 將分離的細(xì)菌分別接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)24～48 h。

1.5.4 衛(wèi)星現(xiàn)象檢查 將鮮血瓊脂平皿分為兩部分,分別接種所分離的細(xì)菌。在其中一部分劃線接種金黃色葡萄球菌,培養(yǎng)24～48 h。

1.5.5 疑似菌株生化鑒定 無菌挑取純化菌落,接種于無NAD的鮮血瓊脂平板上,再垂直劃線接種金黃色葡萄球菌,37℃培養(yǎng)24～48 h,觀察是否有“衛(wèi)星現(xiàn)象”和溶血現(xiàn)象,取具有“衛(wèi)星現(xiàn)象”且不溶血的單菌落純培養(yǎng)后接種于脲酶、氧化酶、硝酸鹽還原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微量生化鑒定管(微量生化鑒定管中同時(shí)加入5μL 0.01%NAD及5μL新生胎牛血清),觀察并記錄結(jié)果。

1.5.6 藥敏試驗(yàn) 無菌棉簽蘸取分離菌的肉湯培養(yǎng)物,涂布接種于巧克力瓊脂平板,待稍干燥后,用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼于培養(yǎng)基表面,37℃培養(yǎng)20～24 h后,觀察測(cè)定抑菌環(huán)的大小。

判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌環(huán)直徑在15 mm以上的為高度敏感 ;10～15 mm為中度敏感;10 mm以下為低度敏感;無抑菌環(huán)的為不敏感。

2 結(jié)果

2.1 染色鏡檢 對(duì)不同組織、部位所取的病料,經(jīng)染色后均見到革蘭陰性的細(xì)小桿菌。菌體形態(tài)多樣,以纖細(xì)桿狀者居多,間有長(zhǎng)而彎曲絲狀菌體,個(gè)別呈兩極濃染的球桿狀。

2.2 分離培養(yǎng)結(jié)果 病料接種于巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24～48 h后生長(zhǎng)良好,形成針尖大小、圓形、半透明、光滑濕潤(rùn)的菌落;在普通肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂,37℃培養(yǎng)24 h后,未見細(xì)菌生長(zhǎng);在血平板上培養(yǎng)48 h,可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長(zhǎng),不表現(xiàn)溶血現(xiàn)象;其中以5%～10%CO2培養(yǎng)的菌落較多,涂片鏡檢,形態(tài)和染色特征與直接涂片一致。

2.3 生長(zhǎng)因子需要試驗(yàn) 分離菌在 TSA(含NAD)平板,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,出現(xiàn)無色、透明、濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊的針頭大小菌落,鏡檢可見大小不一,形態(tài)有細(xì)長(zhǎng)、絲狀、球桿狀的革蘭陰性桿菌,符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)和染色特征;接種無NAD的TSA不生長(zhǎng)。

2.4 衛(wèi)星現(xiàn)象檢查 接種血瓊脂平板分離菌在金黃色葡萄球菌線兩側(cè)有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長(zhǎng),距金黃色葡萄球菌愈近菌落越大,愈遠(yuǎn)菌落較小,呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”;而在未接種金黃色葡萄球菌的另半部分則生長(zhǎng)不良,菌落稀少,不見“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

2.5 生化試驗(yàn)結(jié)果 見表1。

從表1可得:分離菌發(fā)酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖;硝酸鹽陽(yáng)性;氧化酶、吲哚、尿酶陰性,該結(jié)果符合副豬嗜血桿菌的生化特性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 見表2。

由表2可見,23株分離株對(duì)藥物呈現(xiàn)不同的敏感性,有10株對(duì)四環(huán)素、4株對(duì)鏈霉素高度敏感;有10～20株對(duì)新霉素、慶大霉素、林可霉素中度敏感;有6～15株對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、土霉素耐藥;而且分離菌株有多株出現(xiàn)多重耐藥性。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn) (抑菌環(huán)直徑:mm)

3 討論與小結(jié)

近年來,由副豬嗜血桿菌引起的豬群多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎等在我國(guó)常有發(fā)生,且多發(fā)于春冬氣候驟變季節(jié),給規(guī)?；i場(chǎng)造成的經(jīng)濟(jì)損失較大。副豬嗜血桿菌在病料中的分離率比較低,一般患病豬死亡12 h后,在病料中幾乎分離不到,因此需在患豬剖殺或死亡12 h內(nèi)及時(shí)進(jìn)行病原分離,而且其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻,其在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h生長(zhǎng)也較差。一般該菌的分離應(yīng)采用含NAD、酵母浸出液和10%馬血清的TSA培養(yǎng)基。通過對(duì)豫北地區(qū)患病豬進(jìn)行病原菌的分離鑒定、生化試驗(yàn),得到了23株副豬嗜血桿菌,對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果顯示該地區(qū)流行株嚴(yán)重多重耐藥,部分菌株對(duì)環(huán)丙沙星、四環(huán)素高度敏感;6～15株對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新若明、土霉素耐藥;而且分離菌株有多株出現(xiàn)多重耐藥性,這也與該病原菌水平傳播和克隆傳播有關(guān)。

豬副嗜血桿菌在一個(gè)豬場(chǎng)中經(jīng)常存在幾個(gè)菌株或幾個(gè)血清型的情況,給疫苗免疫帶來困難;而且耐藥性產(chǎn)生速度較快,藥物治療效果不穩(wěn)定,故臨床應(yīng)根據(jù)分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合理科學(xué)的用藥,防止該菌耐藥性的發(fā)生及有效治療。

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