種番鴨呼腸孤病毒的分離及RT-PCR鑒定

施少華,萬春和,程龍飛,傅光華,陳紅梅,林 芳,林建生,黃 瑜

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013;2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心,福建 福州 350013)

番鴨呼腸孤病毒病是由呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬番鴨呼腸孤病毒引起的番鴨病毒性傳染病。該病主要發(fā)生于40日齡內(nèi)番鴨,臨床上以肝、脾表面壞死,纖維素性心包炎為主要病變[1]。目前該病有呈多致病型發(fā)生的態(tài)勢[2]。

2010年1月,浙江省諸暨市某鴨場飼養(yǎng)4000羽240日齡種番鴨,按常規(guī)免疫程序進(jìn)行了H5和H9亞型禽流感疫苗免疫。發(fā)病前產(chǎn)蛋率約20%(793枚/4000只),之后開始發(fā)病,3 d內(nèi)共死亡17只,發(fā)病第4天后產(chǎn)蛋量下降到200枚。病鴨主要表現(xiàn)精神委頓、食欲不振、生長緩慢等。剖檢可見種番鴨肝臟、胰腺、脾臟表面有少量白色壞死點(diǎn)等病變。經(jīng)病原分離鑒定,初步認(rèn)定該病原為呼腸孤病毒科成員。

1 材料與方法

1.1 酶、試劑及禽胚 Trizol購自Invitrogen公司;M-MLV Reverse Transcriptase、Go Taq DNA聚合酶購自 Promega公司;d NT P Mixture、DNA Marker DL-2000購自寶生物工程(大連)有限公司;瓊脂糖為OXIOD公司產(chǎn)品;其他試劑為國產(chǎn)分析純。試驗(yàn)用10日齡番鴨胚來源于福建莆田某健康種鴨場。

1.2 病原分離 無菌采集呈典型病變的種番鴨肝臟,處理后接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基,于37℃有氧和厭氧培養(yǎng)48 h,觀察有無細(xì)菌生長。同時(shí)將種番鴨的肝臟剪碎后按照組織重量1∶4加入滅菌PBS,反復(fù)凍融3次后8000 r/min離心5 min,取上清用0.22μm的過濾器除菌,濾過液經(jīng)尿囊腔接種10日齡番鴨胚6枚,0.2 mL/胚;同時(shí)接種滅菌PBS作為對照。每天觀察2次。收集24～96 h死亡鴨胚的尿囊液,進(jìn)行無菌檢查和雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)后,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR鑒定及序列分析

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[3],可擴(kuò)增番鴨呼腸孤病毒S1基因,其理論擴(kuò)增長度為300 bp,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取病毒株感染的鴨胚尿囊液于10000 r/min(4℃)離心10 min以去除雜質(zhì),收集上清液參照Trizol說明書操作對病毒RNA進(jìn)行提取,最后每250μL尿囊液的病毒RNA用5 μL DEPC水溶解。反轉(zhuǎn)錄按 M-MLV Reverse Transcriptase說明書進(jìn)行,具體如下:將制備好的RNA 5μL,加入200 pmol/μL 隨機(jī)引物 1μL,MMLV RT 5×Buffer 4μL,2.5 mmol/L d NTP Mixture 8 μL,40 U/μL Ribonuclease Inhibitor 1 μL,200 U/μL M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL,混勻后按以下程序進(jìn)行RT:30℃10 min,37℃60 min,99℃5 min,保存于4℃。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25μL:取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,2×Go Taq Mix Buffer 12.5μL,上、下游引物各1μL,dd H2 O補(bǔ)齊至25μL后按以下程序進(jìn)行PCR:95℃變性3 min后,94℃變性40 s,53℃退火40 s,72℃延伸40 s,共35循環(huán),最后72℃延伸10 min,保存于4℃。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 克隆測序 PCR產(chǎn)物回收純化后連接到p MD18-T載體,轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐青霉素的LB平板上,37℃培養(yǎng)12～16 h,挑取單個(gè)菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基,37℃、200 r/min振蕩過夜,取2μL菌液按1.3進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果陽性者送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.5 序列比對分析 將所獲得的測序結(jié)果用DNAStar軟件包MegAlign程序進(jìn)行比對,并分析種番鴨呼腸孤病毒ZJ-10-06株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 病原分離 從病死鴨肝臟取樣接種于血瓊脂平板,37℃培養(yǎng)后48 h未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長,基本排除細(xì)菌感染的可能。病料樣品接種鴨胚后在48～96 h死亡,可見胚體全身水腫、出血,肝臟表面出血或有白色壞死點(diǎn)。收集死亡鴨胚的尿囊液,經(jīng)檢驗(yàn)無細(xì)菌污染和病毒無血凝活性,暫命名為ZJ-10-06株。

2.2 RT-PCR鑒定 用番鴨呼腸孤病毒特異性引物對ZJ-10-06株進(jìn)展擴(kuò)增,產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。如圖所示,特異性引物能成功擴(kuò)增出1條300 bp的電泳條帶,而空白對照則無法擴(kuò)增出特異條帶。

圖1 番鴨呼腸孤病毒ZJ-10-06株的RT-PCR檢測

2.3 基因序列分析 將所擴(kuò)增的300 bp的目的片段進(jìn)行回收純化、克隆測序,所獲序列的比對結(jié)果見表1,試驗(yàn)株ZJ-10-06株與番鴨呼呼腸孤病毒HC/China株同源率最高,為95.8%,與法國番鴨呼腸孤病毒株89026的同源率為89.9%,與我國病毒株MW9710株的同源率為93.8%。通過構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)法國番鴨呼腸孤病毒株89026與我國番鴨呼腸孤病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系相對較遠(yuǎn),而后者也可分為2分支,ZJ-10-06與HC/China病毒株共聚一分支(II支)(圖2)。

圖2 番鴨呼腸孤病毒ZJ-10-06株的遺傳進(jìn)化分析

3 討論

鴨呼腸孤病初見于南非學(xué)者的描述,之后相繼在法國、以色列、意大利、德國等國發(fā)生[1]。該病在我國福建、浙江、廣東等省主要養(yǎng)鴨區(qū)均有發(fā)生。目前國內(nèi)外多見于雛番鴨感染呼腸孤病毒的報(bào)道,而在大日齡種番鴨感染此病毒則鮮為介紹。

本試驗(yàn)自以肝臟、胰腺、脾臟表面出現(xiàn)的白色壞死點(diǎn)為特征的典型病死種番鴨臟器中分離到病毒,經(jīng)對分離的病毒株進(jìn)行RT-PCR鑒定及序列分析表明,初步確定ZJ-10-06株病毒為呼腸孤病毒。之后仍將從理化特性、血清學(xué)特性和分子生物學(xué)特性等方面加以佐證。

序列分析表明,ZJ-10-06與引起鴨脾壞死癥HC/China病毒株同源率最高;從遺傳進(jìn)化關(guān)系上看,ZJ-10-06與HC/China病毒株共聚于II支,而與法國番鴨呼腸孤病毒89026和我國病毒株MW9710關(guān)系較遠(yuǎn),表明了番鴨呼腸孤病毒S1基因序列發(fā)生了變異。

表1 番鴨呼腸孤病毒ZJ-10-06株與參考株的核苷酸同源性分析

[1] 胡奇林,陳少鶯,林鋒強(qiáng),等.番鴨呼腸孤病毒的鑒定[J].病毒學(xué)報(bào),2004,20(3):242-248.

[2] 黃瑜,蘇敬良,施少華,等.我國鴨呼腸孤病毒感染相關(guān)的疫病[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45(7):57-58.

[3] 胡奇林,林鋒強(qiáng),陳少鶯,等.應(yīng)用RT-PC R技術(shù)檢測番鴨呼腸孤病毒[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,24(3):231-232.