氯解磷定注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立

王貴英（貴州省藥品檢驗(yàn)所，貴陽市 550004）

氯解磷定注射液屬于解毒藥類，臨床上主要用于有機(jī)磷酸酯類中毒的解救，主要用法有肌內(nèi)注射和靜脈注射。該藥收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)1996年版（二部）第五冊[1]，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無安全性檢查項(xiàng)。為了更好地控制其質(zhì)量，筆者查閱了相關(guān)資料，雖有文獻(xiàn)[2]報(bào)道復(fù)方氯解磷定注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法，但關(guān)于氯解磷定注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。筆者參照《中國藥典》2010年版[3]（二部）附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”及相關(guān)文獻(xiàn)[2]，對氯解磷定注射液應(yīng)用鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法可行性作了研究。

1 儀器與試藥

電熱恒溫水浴箱（國營創(chuàng)新醫(yī)療器械廠）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

氯解磷定注射液（上海旭東海普制藥有限公司，批號：090902、091001、091101、100301，規(guī)格：0.5 g ∶2m L）；鱟試劑（以下簡稱TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批號：0807170，規(guī)格：每支0.1m L，靈敏度：0.25 EU·m L－1；湛江安度斯生物有限公司，批號：1004162，規(guī)格：每支0.1m L，靈敏度：0.25 EU·m L－1）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號：2007-4，效價(jià)：每支150 EU）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（以下簡稱BET水，批號：2008-04，規(guī)格：每支10m L）均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)氯解磷定注射液說明書得知該藥用法用量為：肌內(nèi)注射，每次0.75～1.0 g；靜脈注射，每次0.5～0.75 g。嚴(yán)重中毒：1～1.5 g（2～3支）。根據(jù)公式：L＝K·M－1，其中M為1 500 mg·60 kg－1·h－1＝25mg·kg－1·h－1；K＝5 EU·kg－1·h－1，則限值L＝0.2 EU·mg－1，最終確定限值為0.2 EU·mg－1。

2.2 TAL靈敏度復(fù)核

按照《中國藥典》2010年版（二部）“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定[3]，進(jìn)行TAL的標(biāo)示靈敏度復(fù)核，結(jié)果2批TAL經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查靈敏度（λc）與標(biāo)示靈敏度（λ）一致，結(jié)果均符合規(guī)定，詳見表1（表中“+”表示反應(yīng)呈陽性，“-”表示反應(yīng)呈陰性；下表同）。

表1 TAL靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab 1 Recheck of TAL sensitivity

2.3 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)

2.3.1 樣品有效稀釋濃度（MVC）的計(jì)算[2]。計(jì)算公式為MVC＝λ·L－1，由于L為0.2 EU·mg－1，λ為TAL標(biāo)示靈敏度，目前市售TAL的λ通常為0.5～0.03 EU·m L－1，則氯解磷定注射液的對應(yīng)有效稀釋濃度為c0.5＝2.5mg·m L－1、c0.25＝1.25mg·m L－1、c0.125＝0.625mg·m L－1、c0.06＝0.3mg·m L－1、c0.03＝0.15mg·m L－1。

2.3.2 試驗(yàn)操作。將樣品（批號：090902）用BET水稀釋為含氯解磷定濃度20、10、5、2.5、1.25、0.625mg·m L－1的溶液，將此系列濃度溶液記為NPC。另制備同樣系列濃度的供試液，并使每一濃度的供試液中均含有2λ（0.5 EU·m L－1）濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記此系列溶液為PPC。取靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL，分別與上述NPC和PPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)2管，并設(shè)陽性對照記為PC和陰性對照記為NC，混勻后封口，置于37℃恒溫水浴60m in，反應(yīng)結(jié)果見表2。

表2 樣品干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Resultsof prelim inary interference testof samp les

表2結(jié)果表明：用靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL對樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)，結(jié)果樣品濃度在10mg·m L－1及以下濃度時(shí)無抑制干擾作用。

2.4 正式干擾試驗(yàn)

為了最終確認(rèn)是否存在抑制因素的影響，進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。取3批樣品用BET水稀釋至10mg·m L－1，用該濃度溶液和BET水分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成含內(nèi)毒素0.5（2 λ）、0.25（λ）、0.125（0.5 λ）、0.06（0.25 λ）EU·m L－1的溶液，分別與2個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL反應(yīng)，每一濃度重復(fù)4管，并設(shè)陰性對照，按《中國藥典》2010年版（二部）“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試品干擾試驗(yàn)”項(xiàng)[3]進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Resultsof interference testof sam ples

表3結(jié)果表明：3批樣品濃度為10mg·m L－1時(shí)用2個(gè)廠家靈敏度均為0.25 EU·m L－1的TAL進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果BET水制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及供試品溶液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）在0.5 Es～2 Es（包括0.5 Es和2 Es）內(nèi)，符合《中國藥典》規(guī)定，確認(rèn)供試品在該濃度下無干擾作用。

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

按《中國藥典》2010年版（二部）“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[3]，將4批樣品稀釋至濃度為10mg·m L－1，設(shè)立NPC、PPC、PC和NC，用2個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果見表4。

3 討論

表4 4批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 4 Results of bacteria endotoxin test for four batches of samp les

由預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果可知，氯解磷定注射液稀釋至10mg·m L－1及以下濃度后與靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL反應(yīng)無抑制性干擾。正式干擾試驗(yàn)用3批樣品稀釋至濃度為10mg·m L－1，用2個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果Es/Et均在0.5～2內(nèi)，確認(rèn)無干擾影響。對4批樣品依法檢驗(yàn)，結(jié)果均符合規(guī)定。

與文獻(xiàn)[2]方法比較，二者限值（L）相同，但文獻(xiàn)方法是將理論限值降低了0.05 EU·mg－1而成0.2 EU·mg－1，因?yàn)閺?fù)方制劑要求更加嚴(yán)格。因此參照文獻(xiàn)[2]，本文在進(jìn)行干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)時(shí)，最低濃度只稀釋到0.625mg·m L－1，節(jié)約了成本。2種方法不同之處在于進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，對樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查所用的稀釋濃度不同：文獻(xiàn)方法是按最小有效稀釋濃度（1.25mg·m L－1）進(jìn)行試驗(yàn)，本文則按預(yù)試驗(yàn)時(shí)確定的不干擾濃度（NIC，10mg·m L－1）進(jìn)行試驗(yàn)[4]。因?yàn)轭A(yù)試驗(yàn)的目的就是為了確定NIC，為后續(xù)的驗(yàn)證試驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)臉悠废♂対舛?。樣品在較高的稀釋濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素檢查能合格，更能說明方法是可行的，既減少了稀釋步驟和污染環(huán)節(jié)，也節(jié)約了成本和時(shí)間。有關(guān)文獻(xiàn)[5]要求驗(yàn)證試驗(yàn)選擇的稀釋度至少要比NIC大1～2倍，但不可超過最大有效稀釋倍數(shù)。

本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，氯解磷定注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定為0.2 EU·mg－1，可應(yīng)用TAL進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素法檢查。因此，為提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更有效地控制藥品質(zhì)量，建議氯解磷定注射液增加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)。并擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：取本品，依法檢查，每1mg氯解磷定中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.2EU。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（二部）[S].1996年版.第5冊.1996：101.

[2]高 錦，付 聰，嵇 揚(yáng)，等.復(fù)方氯解磷定注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2008，26（2）：133.

[3]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99-100.

[4]彭 燕，施 震，羅 毅.鹽酸左氧氟沙星注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素法的研究[J].中國藥房，2005，16（1）：60.

[5]王彥厚.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法建立中應(yīng)注意的幾個(gè)問題[N].新藥注冊臨床信息快訊，2007：43.