大劣按蚊絲氨酸蛋白酶AdSP3的組織定位和定量研究

王英,黃復(fù)生,張錫林,徐文岳,段建華

(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室,重慶 400038)

明確某一分子在機(jī)體中不同組織的表達(dá)、分布及轉(zhuǎn)錄水平,對該蛋白的功能研究具有重要提示意義。昆蟲能夠通過其天然免疫機(jī)制防御病原體的入侵感染,其免疫系統(tǒng)包括物理屏障作用、細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)等。其中,絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)能夠調(diào)節(jié)昆蟲的各種免疫反應(yīng),尤其在昆蟲抗入侵病原體的黑化包被反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[1]。絲氨酸蛋白酶能夠催化無活性的PPO蛋白水解成有活性的PO,進(jìn)而啟動(dòng)黑色素的產(chǎn)生和沉積,同時(shí)促進(jìn)傷口愈合和包被反應(yīng)的發(fā)生[2,3]。絲氨酸蛋白酶還參與了細(xì)胞吞噬作用,因?yàn)槔肞PO抗體或PAPs抗體能夠明顯阻斷對細(xì)菌的細(xì)胞吞噬作用;而分裂素活化蛋白激酶能夠通過調(diào)節(jié)PAPs的分泌控制黑化包被反應(yīng)和細(xì)胞吞噬作用[4]。本研究利用 RTPCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù),從mRNA水平研究了絲氨酸蛋白酶3(AdSP3)在大劣按蚊不同組織中的分布及表達(dá)水平與瘧原蟲感染的相關(guān)性,推測該酶在大劣按蚊抗約氏瘧原蟲感染中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大劣按蚊(Anopheles dirus)為我國海南株,約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)為BY265株,感染所用小鼠為昆明株小鼠。

1.2 主要試劑

DEPC購自Sigma公司,瓊脂糖購自O(shè)XOID公司,溴化乙錠和T ripure RNA提取液購自 Roch公司,RT-PCR試劑盒、DNA Marker及DNA膠純化回收試劑盒購自 Takara公司,Taq酶購自Promega公司,SYBR Green I購自天澤基因公司。

2 方法

2.1 PCR方法對蚊體內(nèi)絲氨酸蛋白酶的表達(dá)進(jìn)行組織定位

2.1.1 標(biāo)本采集及總RNA的提取 取正常4日齡大劣按蚊雌性成蚊200只,采用擠壓法(方法同前)將血淋巴細(xì)胞收集入1ml Tripure RNA提取液中,用微量加樣器槍頭吸打數(shù)次。取正常4日齡大劣按蚊雌成蚊20只,解剖獲得蚊胃。取正常4日齡大劣按蚊雌成蚊30只,解剖獲得蚊唾液腺。將采集的蚊胃和唾液腺分別在1 ml的Tripure RNA提取液中進(jìn)行勻漿。常規(guī)方法提取總RNA,并進(jìn)行核酸定量及純度檢測。

2.1.2 反轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA 加樣Total RNA(6 μ l)、5 ×Buffer(4 μ l)、MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶(1 μ l)、dNTP(4 μ l)、Oligo(dT)15(1 μ l)、RNAi(1 μ l)、DEPC 處理水(3 μ l)。混勻后,42℃孵育2 h,99℃5 min滅活 MMLV,備用。

2.1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)本課題組已合成的AdSP3的cDNA序列,利用Primer軟件設(shè)計(jì)引物序列,委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。上游引物序列(5′to3′)CAA CAA GAG GCT GGA TGA AGG,下游引物序列(5′to3′)TGC TGC TGG T TC TCG 。反應(yīng)體系為 cDNA(3.0 μ l)、10×Buffer(2.5 μ l)、5 u/μ l的 Taq 酶(0.3 μ l)、25mM 的 MgCl2(1.5 μ l)、2.5 mM 的 dNTP(2.0 μ l)AdSP3 上游引物 1.0 μ l、Ad-SP3下游引物(1.0 μ l)、ddH2O(13.7 μ l)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,共 35個(gè)循環(huán),最后 72℃再延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2.2 大劣按蚊感染約氏瘧原蟲前后及不同時(shí)相點(diǎn)絲氨酸蛋白酶的轉(zhuǎn)錄水平研究

2.2.1 動(dòng)物感染與實(shí)驗(yàn)分組 設(shè)感染組和正常組,分別吸食感染約氏瘧原蟲的鼠血和正常鼠血。大劣按蚊感染約氏瘧原蟲的方法同前。分別于吸血后1 d、3 d、5 d、7 d和 9 d采集大劣按蚊雌蚊的血淋巴(吸感染血組依次為 I1d 、I3d、I5d、I7d、I9d 和吸正常血組N1d),直接虹吸入 Tripure RNA提取液中?？俁NA的提取及反轉(zhuǎn)錄方法同上。

2.2.2 Real-time PCR 引物同上述 RT-PCR,利用SYBR Green染色法。對以上分組的每組均分別進(jìn)行AdSP3和S7(內(nèi)參照)的擴(kuò)增,另設(shè)AdSP3和S7擴(kuò)增的空白對照管(只加引物,不加模板)。此外,同時(shí)以AdSP1的質(zhì)粒為模板做一標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系 :cDNA 2 μ l、10 ×Buffer 2.5 μ l、5 u/μ l的Taq 酶 0.3 μ l、25 mM 的 MgCl21.5 μ l、2.5 mM 的dNTP 2 μ l、AdSP3上游引物 1 μ l、AdSP3下游引物1 μ l、SYBR Green(1 ∶10000 稀釋液)1 μ l、ddH2O 13.7 μ l。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min后,94℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸1 min,讀板,共35個(gè)循環(huán)。

3 結(jié)果

3.1 絲氨酸蛋白酶在正常大劣按蚊血淋巴細(xì)胞、唾液腺和蚊胃中的分布情況

經(jīng)過RT-PCR及瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外儀內(nèi)可見血淋巴細(xì)胞組(L)和唾液腺組(S)均有一清晰而銳利的420 bp條帶,這與根據(jù)AdSP3序列預(yù)測大小一致。蚊胃組(G)則見多個(gè)條帶(見圖1)。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物Fig.1 Result of 1%agarose electrophoresis to test product of RT-PCR

3.2 大劣按蚊感染約氏瘧原蟲前后及不同時(shí)相點(diǎn)絲氨酸蛋白酶的轉(zhuǎn)錄水平

Real-time PCR結(jié)果中的熔解曲線圖(見圖2)顯示,除主峰外未見雜峰,擴(kuò)增AdSP3的 Tm值(熔解溫度)為80℃,擴(kuò)增S7的 Tm 值為79℃,說明擴(kuò)增效果好,特異性強(qiáng)(無非特異擴(kuò)增)。因此,用于定量研究結(jié)果可信。在對AdSP3和S7的擴(kuò)增中,熒光檢測顯示起跳好,說明擴(kuò)增成功(見圖3)。

根據(jù)檢測結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各試驗(yàn)組的AdSP3和S7的模板含量(拷貝數(shù)),然后求得同組的Ad*SP3與S7模板含量比值(見表1),此比值即可反映各試驗(yàn)組間AdSP3的相對轉(zhuǎn)錄水平(即mRNA水平)。結(jié)果顯示,I7d與I9d兩組間無顯著性差異(P＞0.05),其余各試驗(yàn)組間的AdSP3轉(zhuǎn)錄水平比較均具有顯著性差異(P＜0.01)。I1d組AdSP3的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于同時(shí)相點(diǎn)的N1d組;I3d組則水平下降,低于I1d組;I5d組轉(zhuǎn)錄水平又明顯上升;I7d組AdSP3的轉(zhuǎn)錄水平又明顯回降,I9d組轉(zhuǎn)錄水平與I7d組相當(dāng),趨于穩(wěn)定表達(dá)水平(見圖4)。

圖2 AdSP3和S7的熔解曲線Fig.2 Melting curve of AdSP3 and S7

圖3 AdSP3的Real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Results of Real-time PCR to amplify AdSP3

表1 Real-time PCR結(jié)果中各試驗(yàn)組的轉(zhuǎn)錄水平(n=6,±s)Tab.1 Transcription level of groups shown in the results of Real-time PCR(n=6,±s)

表1 Real-time PCR結(jié)果中各試驗(yàn)組的轉(zhuǎn)錄水平(n=6,±s)Tab.1 Transcription level of groups shown in the results of Real-time PCR(n=6,±s)

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圖4 吸血后不同時(shí)相點(diǎn)大劣按蚊各組AdSP3的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Transcriptions of AdSP3 in An.dirus at different time points after blood feeding

4 討論

4.1 關(guān)于絲氨酸蛋白酶在蚊體內(nèi)的組織定位

本研究首先利用RT-PCR方法,從mRNA水平檢測了AdSP3在大劣按蚊不同組織的分布情況。由結(jié)果看,從血淋巴細(xì)胞和唾液腺中均能成功擴(kuò)增出特異條帶,大小420 bp,與根據(jù)Genbank中的AdSP3序列及引物序列預(yù)測的目的片段大小完全一致。本研究結(jié)果提示,在血淋巴細(xì)胞和唾液腺中存在絲氨酸蛋白酶AdSP3的mRNA,即蚊血淋巴細(xì)胞和唾液腺能夠成功表達(dá)絲氨酸蛋白酶。而在蚊胃中對AdSP3擴(kuò)增,出現(xiàn)多個(gè)條帶,根據(jù)這一結(jié)果我們暫無法確定在蚊胃中有無AdSP3的轉(zhuǎn)錄。

對煙草天蛾組織定位研究顯示,不同的絲氨酸蛋白酶表達(dá)部位并不完全一致:HP13和 HP18只在血淋巴細(xì)胞內(nèi)表達(dá),而HP12和HP20-HP22則僅在脂肪體細(xì)胞表達(dá),其它的HPs則在這兩種細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)[5]。對岡比亞按蚊的研究發(fā)現(xiàn),其絲氨酸蛋白酶Sp22D主要表達(dá)于血淋巴細(xì)胞、脂肪體細(xì)胞和蚊胃上皮細(xì)胞,且蚊胃組織的陽性信號(hào)最強(qiáng)[6]。提示大劣按蚊的各種絲氨酸蛋白酶表達(dá)部位可能也不完全一樣。本研究結(jié)果僅提示AdSP3在血淋巴細(xì)胞和唾液腺內(nèi)有表達(dá),在蚊胃內(nèi)則不確定。

絲氨酸蛋白酶是黑化包被反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶,它能夠催化無活性的PPO蛋白水解成有活性的PO,進(jìn)而啟動(dòng)黑化反應(yīng)的發(fā)生。而黑化包被反應(yīng)是昆蟲天然免疫的重要機(jī)制之一,也是蚊抗瘧原蟲感染的重要方式。絲氨酸蛋白酶在黑化反應(yīng)中作用的發(fā)揮與PPO必然有著緊密的關(guān)系,我室郝宏興等[7]在mRNA水平對PPO的組織定位研究顯示,大劣按蚊AdPPO2和AdPPO3在血淋巴細(xì)胞、唾液腺和蚊胃均有分布。AdSP3與PPO在組織分布上的一致性,提示二者的相關(guān)性及絲氨酸蛋白酶在卵囊黑化反應(yīng)中的重要作用。

4.2 關(guān)于瘧原蟲感染與絲氨酸蛋白酶在血淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平變化的關(guān)系

根據(jù)熔解曲線可見,在PCR過程中基本沒有非特異擴(kuò)增和引物二聚體的產(chǎn)生,使得試驗(yàn)結(jié)果能較好地反映擴(kuò)增的目的片段含量,從而準(zhǔn)確計(jì)算出模板中的cDNA含量。本研究結(jié)果顯示,吸食感染血后1 d的按蚊血淋巴AdSP3的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于同時(shí)相點(diǎn)的吸食正常血組。這與Volz等[8]的研究結(jié)果一致,即感染后1 d時(shí)血淋巴中絲氨酸蛋白酶的含量較吸正常血組增加。瘧原蟲感染按蚊后24 h,正是動(dòng)合子穿過蚊胃壁的過程,這是瘧原蟲感染按蚊蚊胃并形成卵囊的時(shí)期,會(huì)啟動(dòng)一系列的蚊天然免疫[9]。事實(shí)上,昆蟲的各種絲氨酸蛋白酶在感染后24 h的轉(zhuǎn)錄水平變化并不完全一樣。例如煙草天蛾在細(xì)菌攻擊感染后 24 h時(shí)血淋巴細(xì)胞內(nèi)PAP2和血淋巴蛋白 2(HP2)、HP7、HP9、HP10、HP12-HP22的 mRNA水平均增高,血漿中HP12、HP14-HP19、HP21和 HP22等蛋白的濃度在細(xì)菌攻擊感染后24 h也增加;而HP24感染后24 h卻幾乎未見表達(dá)。岡比亞按蚊在進(jìn)行細(xì)菌或瘧原蟲攻擊感染后,其絲氨酸蛋白酶Sp14A、Sp14D1、Sp14D2和Sp22D的轉(zhuǎn)錄均上調(diào),但Sp18D在攻擊感染后mRNA水平則未見增高[6],因此,不同的絲氨酸蛋白酶受到免疫信號(hào)的不同調(diào)節(jié)?？傊?在昆蟲體內(nèi)絲氨酸蛋白酶組成了一個(gè)復(fù)雜的蛋白酶網(wǎng)絡(luò),介導(dǎo)著對創(chuàng)傷和病原體感染的快速防御反應(yīng)[5,10]。本結(jié)果說明,瘧原蟲的感染誘導(dǎo)了按蚊AdSP3的表達(dá)增強(qiáng),進(jìn)一步支持了絲氨酸蛋白酶在蚊抗瘧原蟲感染中的作用。

根據(jù)吸血后不同時(shí)相點(diǎn)的定量檢測,得知吸血后3 d大劣按蚊的AdSP3 mRNA水平明顯下降,這可能由兩個(gè)原因造成:一是感染后24 h時(shí)大量mRNA參與了AdSP3的翻譯、表達(dá),對mRNA的消耗過大;二是感染后3 d時(shí)瘧原蟲已穿過蚊胃壁,在胃基底膜處定位后,卵囊逐漸發(fā)育(這一階段相對較為穩(wěn)定),對按蚊的刺激因子較少,以使得按蚊對Ad-SP3的轉(zhuǎn)錄降低。而蚊感染瘧原蟲后5 d時(shí),Ad-SP3的表達(dá)又明顯增加,提示感染后5 d時(shí)又大量啟動(dòng)了絲氨酸蛋白酶的轉(zhuǎn)錄、表達(dá),以增強(qiáng)黑化反應(yīng)的發(fā)生。我室徐文岳等[11]的研究發(fā)現(xiàn),大劣按蚊對約氏瘧原蟲的卵囊黑化在光鏡下最早于感染后7 d時(shí)發(fā)現(xiàn),因此黑化反應(yīng)的啟動(dòng)則在7 d之前。我室黃復(fù)生等[12]的研究則提示,約氏瘧原蟲感染大劣按蚊后5 d在電鏡下其周圍即可見少數(shù)血細(xì)胞附著,即包被反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生。在蚊對瘧原蟲的黑化包被反應(yīng)中,需要絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)和PPO的活化。因此,絲氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄水平的變化必然與PPO和PO有著密切關(guān)系。我室徐文岳等[13,14]對PPO的研究發(fā)現(xiàn),在吸血后4～5 d,PPO的蛋白合成明顯增強(qiáng);而對PO的研究則顯示,在血餐后5 d時(shí)PO活性最高,之后逐漸下降,這與本結(jié)果中吸血后5 d絲氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄水平增高一致,提示SP與PPO及PO之間轉(zhuǎn)錄水平的變化存在相關(guān)性及它們在黑化反應(yīng)中具有重要作用。由此推斷,大劣按蚊絲氨酸蛋白酶及PPO級(jí)聯(lián)反應(yīng)在血餐后5 d時(shí)達(dá)到高峰。吸血后7 d和9 d較之5 d時(shí)的AdSP3轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下降,并趨于穩(wěn)定水平,這可能是由于免疫刺激因子減少,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平下降并趨于穩(wěn)定。

總之,本試驗(yàn)在mRNA水平研究了AdSP3在大劣按蚊不同組織的表達(dá)分布及吸血和感染瘧原蟲后不同時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)情況。結(jié)果提示,AdSP3在不同組織的分布和其轉(zhuǎn)錄水平的變化與PPO和瘧原蟲的感染相關(guān),說明絲氨酸蛋白酶AdSP3在大劣按蚊抗約氏瘧原蟲感染中可能作為前酚氧化酶活化酶發(fā)揮了重要作用。絲氨酸蛋白酶在蚊抗瘧原蟲感染天然免疫及黑化包被反應(yīng)中的作用是通過復(fù)雜的信號(hào)通路完成的[15],AdSP3在大劣按蚊對約氏瘧原蟲的黑化包被反應(yīng)中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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