HPLC 法測定復(fù)方伐地那非噴霧劑中鹽酸伐地那非的含量

晏亦林，葉勇，張健泓（.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州市5050；.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧市5300）

鹽酸伐地那非是一種新型的治療男性勃起功能障礙（Erectile dysfunction，ED）的高選擇性口服磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑，持續(xù)口服可改善陰莖血管內(nèi)皮功能達(dá)到治愈ED的目的[1]，其機(jī)制是通過抑制PDE5維持環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的高水平，導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌松弛舒張而引發(fā)勃起[2]。2003年美國食品與藥品管理局（FDA）正式批準(zhǔn)伐地那非作為ED的治療藥物上市，是繼西地那非之后第2個上市的PDE5抑制劑。在其療效得到廣泛驗證的同時，其安全性和耐受性也一直是人們關(guān)注的焦點。文獻(xiàn)[3]報道，鹽酸伐地那非存在口服后出現(xiàn)心肌梗死、腦出血、陰莖異常勃起、陰莖纖維化、嚴(yán)重者致死亡等不良反應(yīng)的可能。為增強(qiáng)療效，減少不良反應(yīng)，方便患者用藥，筆者結(jié)合該藥的理化性質(zhì)和鼻腔給藥的特點，制備了鼻用復(fù)方伐地那非噴霧劑，藥效學(xué)研究表明該噴霧劑具有吸收迅速、起效快、副作用少等優(yōu)點（研究結(jié)果另文發(fā)表）。為控制該制劑的質(zhì)量，本研究建立了該制劑中鹽酸伐地那非含量的測定方法，介紹如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

L-2000高效液相色譜系統(tǒng)，包括L-2100（SMASH）泵、L-2200自動進(jìn)樣器、L-2400紫外（可見）檢測器、N-2000色譜工作站（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；pHS-25型酸度計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 試藥

復(fù)方伐地那非噴霧劑（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院自制，批號：080708-1、080708-2、080708-3，規(guī)格：160 mg∶2 mL）；鹽酸伐地那非對照品（美國Sigma公司，純度：99.68%）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.2%甲酸-2.5%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（60∶10∶30，三乙胺調(diào)節(jié)pH至3.5）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：242 nm；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按鹽酸伐地那非峰計應(yīng)不得低于3 000，分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備與干擾試驗

2.2.1 對照品溶液的制備：取干燥至恒重的鹽酸伐地那非對照品約12 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.497 6 mg·mL－1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備：精密量取本品1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再從中精密吸取2 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備：按處方比例制備缺鹽酸伐地那非的陰性樣品噴霧劑，照“2.2.2”項下方法制得陰性樣品溶液。2.2.4 干擾試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜。記錄的供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的色譜峰（鹽酸伐地那非的保留時間約為7.5 min）；陰性樣品色譜在相應(yīng)的位置上無干擾峰，說明處方中的其他物質(zhì)對主藥測定結(jié)果無干擾。相關(guān)色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC Chromatograms

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取上述制備好的對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取10μL進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計算回歸方程為Y＝2 820 665.59X+25 053.6（r＝0.999 9），結(jié)果表明，鹽酸伐地那非進(jìn)樣量線性范圍為0.248 8～1.244μg。

2.4 精密度試驗

精密吸取濃度為0.062 2 mg·mL－1的對照品溶液在同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，結(jié)果日內(nèi)RSD＝0.26%。另連續(xù)測定5 d，每日進(jìn)樣1次，結(jié)果日間RSD＝0.51%。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品（080708-3）5份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，0.45μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣，測定峰面積，計算含量，結(jié)果平均含量為98.94%，RSD＝0.36%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（080708-3）分別在0、2、4、8、12 h內(nèi)測定峰面積，結(jié)果RSD＝0.31%，表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗

取鹽酸伐地那非對照品與處方中其他物質(zhì)，按處方比例制成相當(dāng)于主藥濃度80%、100%、120%的溶液各3份，照“2.8”項下方法測定，計算平均回收率。結(jié)果，平均回收率為98.78%，RSD＝0.53%，回收率均在98.0%～102.0%之間，低、中、高濃度回收率平均分別為98.60%、99.23%、98.51%，詳見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（sn＝9）

2.8 樣品含量測定

精密量取本品1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，再從中精密吸取2 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜，按外標(biāo)法以峰面積計算含量。結(jié)果，3批樣品含量均符合要求（應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110.0%），詳見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of content determination of sample（sn＝3）

3 討論

本制劑主要由鹽酸伐地那非等2種治療勃起功能障礙的藥物與適量的防腐劑、助溶劑組方而成。該制劑的主要溶劑是水，經(jīng)試驗驗證，樣品經(jīng)過稀釋過濾后完全能夠滿足分析要求。

經(jīng)對對照品溶液的紫外光譜測定及文獻(xiàn)[4]對比發(fā)現(xiàn)，鹽酸伐地那非總體沒有明顯的特征吸收峰，最大吸收波長約為210 nm，在此末端吸收波長下，筆者發(fā)現(xiàn)其檢測所需的儀器穩(wěn)定性及色譜條件要求較高。此外，在242 nm波長處有1個肩峰，因此，選擇242 nm為鹽酸伐地那非的檢測波長。經(jīng)驗證，此檢測波長下具有較高的檢測靈敏度。

在反相高效液相色譜分析中，選擇正確的流動相pH值對堿性或者酸性化合物分析的重現(xiàn)性十分重要，不恰當(dāng)?shù)膒H值可能導(dǎo)致不對稱峰、寬峰、分裂峰或肩峰。筆者考察了不同pH值條件下流動相對鹽酸伐地那非峰形及分離度的影響：當(dāng)將流動相pH值調(diào)整到3.0時，鹽酸伐地那非的分離度達(dá)不到要求；將流動相pH值調(diào)整到4.0時，鹽酸伐地那非的分離度雖達(dá)到要求，但峰形拖尾；而將流動相pH值調(diào)節(jié)到3.5時，鹽酸伐地那非峰形及分離度均達(dá)到理想的要求。

本試驗建立的高效液相色譜法可準(zhǔn)確定量分析鹽酸伐地那非原料及相關(guān)制劑中主成分的含量，方法準(zhǔn)確、可靠、專屬性強(qiáng)，能滿足制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，可用于鹽酸伐地那非常規(guī)檢測及其穩(wěn)定性等相關(guān)研究。

[1] 時群峰，馮 亮.持續(xù)口服鹽酸伐地那非治療勃起功能障礙的臨床分析[J].江西醫(yī)藥，2010，45（8）：786.

[2] Vitezie D.A risk-benefit assessment of sildenafil in the treatment of erectile dysfunction[J].Drug Safety，2001，24（4）：255.

[3] 陳 亮，鐘 偉，辛鐘成，等.2 062例艾力達(dá)（鹽酸伐地那非）不良反應(yīng)報告分析[J].中國男科學(xué)雜志，2009，23（1）：35.

[4] Subba Rao DV，Surendranath KV，Radhakrishnanand P，et al.A stability indicating LC method for vardenafil HCl[J].Chromatographia，2008，68（9-10）：829.