含酚爐甘石洗劑微生物限度檢查方法學(xué)的驗(yàn)證

李遼閩 曾慶莉

（1 湖北省襄陽市婦幼保健院，湖北 襄陽 441000；2 湖北省黃石市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖北 黃石 435000）

含酚爐甘石洗劑為淡紅色懸浮液，有薄荷腦、苯酚特臭。外用止癢、輕度收斂，保護(hù)皮膚，用于濕疹、皮疹、皮膚瘙癢癥等。其成份為苯酚、爐甘石、氧化鋅、樟腦、薄荷腦等。由于本品為混懸液，又具有較強(qiáng)的抑菌作用，采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法難以除去其抑菌成分，我們采用離心沉淀集菌法[1]，取底部集菌液約2mL，按中國(guó)藥典2005年版二部相關(guān)規(guī)定[2]進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，該方法省時(shí)、易操作，適用于含酚爐甘石洗劑的微生物限度檢查。

1 儀器、試藥和菌種

1.1 生物安全柜、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、生化培養(yǎng)箱（23～28℃）、電熱干燥箱（160～250℃）、立式滅菌器、電子天平、離心沉淀器、超凈臺(tái)。

1.2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、改良馬丁氏液體培養(yǎng)基、改良馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基，均由北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 稀釋劑：氯化鈉-蛋白胨緩沖液，由北京陸橋技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.4 菌種：大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；所有菌種均為第四代。

1.5 樣品:含酚爐甘石洗劑（批號(hào)：100305、100507、100916，100mL/瓶）襄陽市婦幼保健院制劑室。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法驗(yàn)證試驗(yàn)

2.1.1 菌液的制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h，各取1mL，分別加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5～10-7，活菌數(shù)約為50～100cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

表1 菌落計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果（cfu）

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁氏液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)18～24h，取1mL，加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-5～10-7，活菌數(shù)約為50～100cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁氏瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)1周，加5mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，吸出菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁。取1mL，加9mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10-4，活菌數(shù)約為50～100cfu/mL，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.2 供試液的制備

吸取樣品10mL至有無菌玻璃珠的250mL三角燒瓶中，加90mL無菌的稀釋液，混勻，使成1∶10的供試液。取此液10mL，以500轉(zhuǎn)/分離心5min，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心10min，棄去上清液，留底部集菌液約2mL，加稀釋劑至10mL備用。

2.1.3 回收率測(cè)定

①試驗(yàn)組：取1∶10備用的供試液1mL，加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌各1mL（50～100cfu/mL），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)瓊脂、改良馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基）。每株試驗(yàn)菌平行制作兩個(gè)平皿，培養(yǎng)24～72h觀察結(jié)果。②菌液組：除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。③供試品對(duì)照組：除不加菌懸液外，其余操作同試驗(yàn)組。④稀釋劑對(duì)照組：用稀釋劑取代供試液，其余操作同試驗(yàn)組。

2.1.4 結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)至少進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。（所得回收率均不低于70%）

結(jié)論：采用離心沉淀集菌法檢驗(yàn)含酚爐甘石洗劑，該試驗(yàn)對(duì)5種菌種的回收率均高于70%，該驗(yàn)證試驗(yàn)通過。結(jié)果見表1。

2.2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)

①試驗(yàn)組：取1∶10備用的供試液10mL，加入到100mL無菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，加1mL金黃色葡萄球（50～100cfu/mL），35℃培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物，劃線接入甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。②陰性菌對(duì)照組：取1∶10備用的供試液10mL，加入到100mL無菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，加入1mL大腸埃希菌（50～100cfu/mL），35℃培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物，劃線接入甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。③陽性對(duì)照組：除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。④陰性對(duì)照組：用稀釋液取代供試液，不加菌液，其余操作同試驗(yàn)組。

結(jié)果：陰性菌對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌;試驗(yàn)組檢出金黃色葡萄球;陽性對(duì)照組檢出金黃色葡萄球；陰性對(duì)照組無菌生長(zhǎng)。

結(jié)論：根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，表明供試品可采用離心沉淀集菌法檢驗(yàn)金黃色葡萄球

2.3 銅綠假單胞菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)

①試驗(yàn)組：取1∶10備用的供試液10mL，加入到100mL無菌的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，加入1mL銅綠假單胞菌（50～100cfu/mL），35℃培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物，劃線接入溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。②陰性菌對(duì)照組：取1∶10備用的供試液10mL，加入到100mL無菌的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，加入1mL大腸埃希菌（50～100cfu/mL），35℃培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物，劃線接入溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)24h。③陽性對(duì)照組：除不加供試液外，其余操作同試驗(yàn)組。④陰性對(duì)照組：用稀釋液取代供試液，不加菌液，其余操作同試驗(yàn)組。

結(jié)果：陰性菌對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌;試驗(yàn)組檢出銅綠假單胞菌;陽性對(duì)照組檢出銅綠假單胞菌；陰性對(duì)照組無菌生長(zhǎng)。

結(jié)論：根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，表明供試品可采用離心沉淀集菌法檢驗(yàn)銅綠假單胞菌。

3 討 論

經(jīng)過試驗(yàn)觀察，說明用離心沉淀集菌法處理過的供試液適合各種試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)；供試品對(duì)照組無菌生長(zhǎng)說明供試品中無影響試驗(yàn)的雜菌；菌液組各種菌生長(zhǎng)良好，說明該方法的實(shí)驗(yàn)環(huán)境適合參加試驗(yàn)的各種菌的生長(zhǎng)；陰性對(duì)照組無菌生長(zhǎng)，說明稀釋劑、培養(yǎng)基及試驗(yàn)操作過程符合無菌操作的標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用離心沉淀集菌法能有效去除含酚爐甘石洗劑的抑菌成分，對(duì)試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)無影響，該方法適合含酚爐甘石洗劑的微生物限度檢查。

[1] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:60.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典.2005.二部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄XI J.