金絲桃素抑制慢性病毒性心肌炎小鼠心肌組織病理學(xué)改變

李 樂 張益靈 陶厚權(quán) 丁寶興 王本蘭

（1 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2 浙江省人民醫(yī)院重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 310014；3 西安醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，陜西 西安 710061）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM） 是由親心肌病毒感染所致的以心肌炎癥病變?yōu)橹鞯男募〖膊?。病因?qū)W以柯薩奇B組病毒（Coxsackievirus group B，CVB）感染較為常見，其發(fā)病機(jī)制一直未明了，也無滿意的治療方法[1]。金絲桃素（Hypericin，Hyp）是從貫葉連翹中提取的萘駢二蒽酮化合物，能對抗多種逆轉(zhuǎn)錄病毒[2]；我們以往的研究表明，金絲桃素具有明顯抗CVB3復(fù)制和心肌細(xì)胞保護(hù)作用[3]。本實驗在小鼠慢性心肌炎模型上，進(jìn)一步觀察該藥對心肌組織病理學(xué)變化的對抗作用，研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品和儀器

金絲桃素，購自Sigma 公司，石蠟切片機(jī)M2135 型德國LEICA公司，光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司。Ttecnaibiowin 透射電鏡，PHILIPS 公司。

1.2 實驗動物

清潔級 Balb/C小鼠，3周齡，雄性，體質(zhì)量16～19g，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：2010073。

1.3 柯薩奇B3病毒（CVB3），Nancy 株，TCID50= 10–6，在Hela-2細(xì)胞中傳代，凍融離心三次，上清液分裝，在細(xì)胞測出50%組織感染率（TCID50）為10–7–700C低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗方法

動物分組、模型的制備及給藥方法、用量：取3周齡，雄性、正常Balb/C小鼠210只，設(shè)15只腹腔接種不含病毒的Eagle' s液小鼠為正常對照組，其余小鼠腹腔注射內(nèi)含100TCID50的CVB3病毒稀釋液0.lmL/只，常規(guī)飼養(yǎng)后每隔15d腹腔接種同種濃度病毒液0.lmL/只，共3次，60d后成活小鼠為病毒性心肌炎慢性期心肌纖維化模型（經(jīng)蘇木精-伊紅染色確定模型成功），共120只，隨后存活小鼠分為模型組、卡托普利組、金絲桃素高、中、低劑量組。金絲桃素治療組分別按50mg、15mg、5mg/kg灌胃，卡托普利治療組按50mg/kg灌胃，模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，療程為30d。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

正常對照組，小鼠活動自如，反應(yīng)靈敏，食量正常，毛發(fā)光亮柔順；模型組，小鼠活動減少，反應(yīng)遲鈍，食量減少，毛發(fā)卷曲稀疏少光澤，體質(zhì)量減輕；金絲桃素組，小鼠活動尚好，反應(yīng)靈敏，食量體質(zhì)量較卡托普利組少，但強(qiáng)于模型組，毛發(fā)欠光澤；卡托普利組，小鼠活動較活潑，反應(yīng)靈敏，食量體質(zhì)量接近正常，毛發(fā)柔順有光澤。各組小鼠死亡率見表1。

2.2 一般組織形態(tài)學(xué)觀察

肉眼觀察: 正常對照組小鼠心臟色澤鮮紅，心外膜下未見白色點(diǎn)狀病變。模型組小鼠心臟95%出現(xiàn)病變，心臟擴(kuò)大，心外膜下可見白色點(diǎn)狀斑塊、條索狀病變，以斑塊狀居多，與文獻(xiàn)報道[4]相似?？ㄍ衅绽M小鼠病變以點(diǎn)狀為主。而金絲桃素組有10%以斑塊為主，90%以點(diǎn)狀病變?yōu)橹鳌?/p>

光鏡觀察：正常對照組小鼠：心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，結(jié)構(gòu)清晰，胞核卵圓形，肌纖維排列緊密有序，心肌橫紋清晰，未見肌纖維溶解、單核細(xì)胞浸潤及心肌細(xì)胞壞死、心肌纖維化病變。VMC 組小鼠：心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌橫紋不清，炎性細(xì)胞少許可見，可見鈣化灶，而且M組除血管周圍有膠原纖維外，心肌細(xì)胞間有大量縱橫交錯的膠原纖維，排列紊亂；可見明顯的心肌纖維化，部分地方呈玻璃樣變性。金絲桃素組、卡托普利組與VMC 組表現(xiàn)類似，但可見間質(zhì)內(nèi)增生的膠原纖維顯著減少。

2.3 各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

正常對照組，心肌細(xì)胞胞膜完整，胞內(nèi)細(xì)胞器如線粒體、細(xì)胞核完整，線粒體崤密，豐富，成排分布于肌絲間，肌原纖維連貫，韌盤清晰。模型組，病變輕者，可見線粒體腫脹、崤腔隙變大，部分崤斷裂或模糊等，細(xì)胞核變形，肌原纖維和細(xì)胞膜尚完整；重者細(xì)胞膜破裂，線粒體腫脹、崤模糊不清，大小不一，分布不均，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，肌絲大片溶解或斷裂，紊亂，韌盤斷裂，肌原纖維破壞，與文獻(xiàn)報道[4]相似。金絲桃素組、卡托普利組亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害鉸VMC 組減輕。

3 討 論

貫葉連翹（ Hypericum perforatum L.）為藤黃科金絲桃屬（Hypericum L.）植物貫葉連翹的全草，是近年來繼銀杏之后世界最暢銷草藥[2]金絲桃素（Hypericin，HY）是從貫葉連翹中提取的具有光敏活性和光動力作用的萘駢二蒽酮化合物，具有抗抑郁、抗菌、抗病毒、抗腫瘤和光動力學(xué)活性[2]；同時，國外已申請多項金絲桃素抗病毒劑相關(guān)專利[5]。近來研究表明，金絲桃素對高致病性禽流感病毒（AIV）具有良好的殺滅效果，最后殺滅率可達(dá)100%[6]。金絲桃素對多種病毒（DNA或RNA病毒）包括艾滋病病毒（HIV）有抗病毒作用。尤其對逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒如艾滋病病毒、禽流感病毒等作用顯著，機(jī)制可能與抑制逆轉(zhuǎn)錄酶有關(guān)[7]、CVB3屬小RNA病毒，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒特性。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，金絲桃素具有明顯抗CVB3復(fù)制和心肌細(xì)胞保護(hù)作用，調(diào)節(jié)VM小鼠體內(nèi)干擾素，腫瘤壞死因子等的產(chǎn)生[8]抑制VM心肌細(xì)胞的凋亡，下調(diào)Fas/FasL蛋白表達(dá)[9]。本實驗表明，金絲桃素干預(yù)組和卡托普利干預(yù)組小鼠死亡率明顯少于單純VMC 組。兩用藥組小鼠心肌炎心肌壞死纖維化較模型組明顯減輕，證實金絲桃素對感染CVB3引起的病毒性心肌炎心肌組織病理改變有明顯的抑制作用，作用基本與卡托普利干預(yù)組相當(dāng)，說明金絲桃素治療慢性病毒性心肌炎具有一定的優(yōu)勢和價值，值得進(jìn)一步深入的研究。

表1 各組VMC小鼠死亡率比較

[1] Esfandiarei S,McManus BM.Molecular Biology and Pathogenesis of Viral Myocarditis[J].Annu Rev Pathol Mech Dis,2008,3(1):127–155.

[2] 葉春苗,王淑琴,趙春燕.金絲桃素的研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2007,23(1):28-30.

[3] 李樂,高曉利,丁寶新,等.金絲桃素對柯薩奇B3病毒的抑制及保護(hù)心肌的作用[J].中國基礎(chǔ)醫(yī)藥雜志,2007,13(10):73-76.

[4] 馬路,王忠卯,李文強(qiáng),等.甘草酸二銨對慢性病毒性心肌炎小鼠心肌的保護(hù)作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2008,28(16):1361-1364.

[5] 李健,李遐松.國外開發(fā)金絲桃素抗病毒劑專利簡析[J].中醫(yī)藥研究與信息,2004,6(2):8.

[6] 郭騰,吳連勇.金絲桃素的最新研究進(jìn)展[J].獸藥與飼料添加劑,2006,11(2):7.

[7] Gulick RM.Phase I studies of hypericin,the active compound in St.John’s wort,as an antiretroviral agent in HIV infected adults:AIDS clinical trials group protocols 150 and 258[J].Ann Intern Med,1999,130(6):510.

[8] 李樂,高曉利,丁寶新,等.金絲桃素調(diào)節(jié)病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌[A]. 2008年中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會暨第八屆中國藥師周論文集[C].2008.

[9] 李樂,齊敏友,丁寶新,等.金絲桃素對慢性病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡及Fas/FasL蛋白表達(dá)的影響[J].世界科技研究與發(fā)展,2009,31(2):145-149.