細胞內(nèi)外鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌中的作用

許小洋 許繼德 劉筱藹

（廣州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理教研室，廣東 廣州 510182）

在哮喘的治療中，抑制氣道平滑肌的痙攣仍然是急性期治療的關(guān)鍵[1]。近年來發(fā)現(xiàn)中藥川芎的提取物川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）具有心血管保護作用[2,3]，同時還發(fā)現(xiàn)川芎嗪具有一定的抑制氣管平滑肌痙攣及增殖的效應(yīng)[4,5]。然而，目前對川芎嗪舒張支氣管效應(yīng)的詳細機制尚不明確。各種致痙物質(zhì)最終作用于氣道平滑肌中由鈣離子介導(dǎo)的興奮－收縮耦聯(lián)機制，從而使氣道平滑肌產(chǎn)生痙攣。而氣道平滑肌細胞漿中的鈣來源于胞外鈣內(nèi)流或肌質(zhì)網(wǎng)的鈣釋放，川芎嗪有可能就是通過影響鈣的這兩種來源進而產(chǎn)生其效應(yīng)的。為此，本實驗利用離體灌流的方法，探討川芎嗪舒張氣道平滑肌的效應(yīng)與細胞內(nèi)外鈣離子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑

Hartley豚鼠（中山大學(xué)實驗動物中心）；川芎嗪（TMP，美國Sigma公司）；EGTA 和thap sigargin（TSG，美國Sigma公司）；鹽酸異丙腎上腺素（上海禾豐制藥有限公司，批號：090703）；Krebs-Henseleit 營養(yǎng)液（K-H液）組成如下（mmol/L）：NaCl 120，KCl 4.5，CaCl22.5，NaHCO325，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 0.8，葡萄糖10.1；無鈣K-H液中去除CaCl2，加入0.1mmol/L EGTA。

1.1.2 儀器

HSS-1數(shù)字式超級恒溫浴槽（成都儀器廠），BL-420E生物信號采集處理系統(tǒng)（成都泰盟）。

1.2 實驗方法

1.2.1 豚鼠離體氣管環(huán)制備

健康豚鼠，雌雄不拘，200～250g，擊昏豚鼠，動脈放血致死，立即取出氣管，置K-H液中，制備成氣管螺旋條（含3個軟骨環(huán)）。將標本置37℃ K-H 液水浴槽內(nèi)，通氧氣，將氣管平滑肌環(huán)靜息張力調(diào)至1.5g力（15.7×10-3N）。張力通過張力換能器輸入BL-420E生物信號采集處理系統(tǒng)記錄。氣管平滑肌標本在浴槽內(nèi)穩(wěn)定1h 后開始實驗。

1.2.2 實驗分組

TMP對離體豚鼠氣管平滑肌環(huán)的效應(yīng)觀察分兩組：TMP組和空白組。TMP組分別加入10-6～10-3mol/L TMP，待其基線平穩(wěn)后再加入10-6mol/L的異丙腎上腺素，以異丙腎上腺素的舒張度為100%計算各濃度TMP的舒張率?？瞻捉M則加入等量的K-H 液作為對照。

細胞內(nèi)外鈣在TMP舒張氣管平滑肌中的作用觀察分有鈣K-H 液組和無鈣K-H 液組2大組。有鈣K-H 液組的實驗均在有鈣K-H 液中進行，又分為有鈣＋TMP組和有鈣＋TSG＋TMP組：前組只加入10-3mol/L TMP，后組預(yù)先加入TSG（10mmol/L）40min，再加入10-3mol/L TMP。無鈣K-H 液組的實驗均在無鈣K-H 液中進行，又分為無鈣＋TMP組和無鈣＋TSG＋TMP組：前組只加入10-3mol/L TMP，后組預(yù)先加入TSG（10mmol/L）40min，再加入10-3mol/L TMP。分別記錄靜息張力及給藥后的張力，并計算張力變化值（即差值），差值＝靜息張力－給藥后張力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)的顯著性比較選用組內(nèi)成對數(shù)據(jù)t檢驗或組間獨立樣本t檢驗。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 TMP對離體豚鼠氣管平滑肌的舒張作用

與空白組對照，TMP對離體豚鼠氣道平滑肌具有明顯的舒張作用（P＜0.01），并且呈劑量依賴性（10-6～10-3mol/L），在10-3mol/L濃度時，其舒張率與異丙腎上腺素基本相等（圖1）。

2.2 細胞外鈣在川芎嗪舒張效應(yīng)中的作用

結(jié)果見表1。在有鈣K-H液中，川芎嗪可顯著舒張氣管平滑?。≒＜0.01）；用肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑TSG孵育40分鐘，以耗竭肌漿網(wǎng)儲存的Ca2+，此時川芎嗪仍然具有舒張氣道平滑肌的效應(yīng)（P＜0.01），TSG對TMP的效應(yīng)無顯著影響（P＞0.05）。

表1 細胞外鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌效應(yīng)中的作用(±s，10-3N)

表1 細胞外鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌效應(yīng)中的作用(±s，10-3N)

注：n=10；組間比較指兩組差值的組間比較

有鈣＋TMP 14.70 12.84±1.011.86±1.01 5.849 ＜0.01有鈣＋TSG＋TMP 14.70 12.43±1.322.27±1.32 5.416 ＜0.01組間比較 0.774 0.449

2.3 細胞內(nèi)鈣在川芎嗪舒張效應(yīng)中的作用

結(jié)果見表2。在無鈣K-H液中，川芎嗪對氣管平滑肌的舒張作用雖然也達到顯著性差異的水平（P＜0.05），但其效應(yīng)較弱；而經(jīng)TSG預(yù)孵后，其對氣管平滑肌無明顯舒張效應(yīng)（P＞0.05），兩組間比較無顯著差異（P＞0.05）。川芎嗪在無鈣K-H液中對氣管平滑肌的舒張效應(yīng)（（0.17±0.21）×10-3N）明顯比其在有鈣K-H液中的效應(yīng)（（1.86±1.01）×10-3N，見表1）弱（t＝5.181，P＜0.01）。

表2 細胞內(nèi)鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌效應(yīng)中的作用(±s，10-3N )

表2 細胞內(nèi)鈣在川芎嗪舒張豚鼠氣管平滑肌效應(yīng)中的作用(±s，10-3N )

注：n=10；組間比較指兩組差值的組間比較

無鈣＋TMP 14.70 14.53±0.210.17±0.212.6120.028無鈣＋TSG＋TMP 14.70 14.52±0.320.18±0.321.8220.102組間比較 0.0520.959

3 討 論

抑制氣道平滑肌痙攣是哮喘治療中的重要措施，而氣道平滑肌的痙攣與鈣離子介導(dǎo)的興奮-收縮耦聯(lián)機制密切相關(guān)。興奮－收縮耦聯(lián)中的重要離子Ca2+來源于胞外Ca2+內(nèi)流或肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放。為探討川芎嗪對氣道平滑肌的作用機制是否與影響胞外Ca2+內(nèi)流或肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放有關(guān)，本實驗觀察了有Ca2+和無Ca2+環(huán)境中川芎嗪對離體豚鼠氣管平滑肌環(huán)的效應(yīng)，并且利用肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵抑制劑thap sigargin（TSG）耗竭肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+，以觀察其對川芎嗪氣道平滑肌作用效應(yīng)的影響，從而為探討川芎嗪的作用機制提供實驗依據(jù)。

本實驗的結(jié)果顯示，川芎嗪具有舒張正常離體豚鼠氣管平滑肌的作用。其舒張效應(yīng)呈劑量依賴性（10-6～10-3mol/L）。說明川芎嗪具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

在有鈣K-H液中，用肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑TSG耗竭肌漿網(wǎng)儲存的Ca2+，此時氣管平滑肌的舒縮狀態(tài)主要受細胞外Ca2+的影響，實驗結(jié)果顯示川芎嗪仍然具有舒張氣道平滑肌的效應(yīng)，與未加TSG組的效應(yīng)無顯著差異。表明川芎嗪對離體氣道平滑肌的舒張效應(yīng)與肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+（細胞內(nèi)鈣）釋放的關(guān)系不明顯，即可能主要是通過抑制細胞外Ca2+的內(nèi)流而實現(xiàn)的。

為了進一步闡明Ca2+在川芎嗪舒張氣道平滑肌中的作用，本實驗還在無鈣K-H液中進行了觀察，此時氣管平滑肌的舒縮主要受肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+（細胞內(nèi)鈣）的影響。結(jié)果顯示，在無鈣K-H液中，川芎嗪對氣管平滑肌雖然也有一定的舒張作用，但與其在有鈣K-H液中的作用相比明顯減弱；TSG在無鈣K-H液中對川芎嗪的效應(yīng)無明顯影響。這些結(jié)果進一步提示，川芎嗪主要是影響細胞外Ca2+內(nèi)流而產(chǎn)生舒張效應(yīng)的，肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+（細胞內(nèi)鈣）對其作用無明顯影響。有報道表明，可抑制大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞電壓依賴性鈣通道[6]，提示，川芎嗪對氣道平滑肌的舒張效應(yīng)可能與抑制鈣通道有關(guān)。

綜上所述，川芎嗪可對正常豚鼠離體氣管平滑肌產(chǎn)生明顯舒張作用，其效應(yīng)的產(chǎn)生可能與細胞外Ca2+內(nèi)流的抑制有關(guān)。

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[4] 涂喜漢.川芎嗪治療支氣管哮喘持續(xù)狀態(tài)臨床觀察[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(10): 9.

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[6] 尹春萍,張立冬,劉繼紅,等.N-( 3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲?；?-N’-( 4-氟基苯基)哌嗪對平滑肌細胞游離鈣濃度的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,29(15): 1264-1267.