霉酚酸對(duì)人骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的作用

曹偉杰，劉麗珍，來曉瑜，王沖，于曉虹，黃 河

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，河南鄭州450052)

霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)是霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)在體內(nèi)代謝后的活性成分，它是一種強(qiáng)效非競(jìng)爭(zhēng)性次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)抑制劑。MPA通過抑制IMPDH，耗竭T細(xì)胞和B細(xì)胞內(nèi)的鳥嘌呤核苷酸和脫氧鳥嘌呤核苷酸，抑制這兩種細(xì)胞的增殖以及抑制B細(xì)胞生成免疫球蛋白［1］。目前MMF作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于實(shí)體器官移植和異基因造血干細(xì)胞移植，而且在治療自身免疫性疾病方面也顯示了良好的應(yīng)用前景。近年來研究表明，MPA不僅僅作用于免疫細(xì)胞，對(duì)多種非免疫細(xì)胞也有一定的作用，如能明顯抑制成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腎小球膜細(xì)胞的增殖［2-4］。最新研究表明，MMF對(duì)多發(fā)性骨髓瘤、T細(xì)胞淋巴瘤和B細(xì)胞淋巴瘤等血液惡性腫瘤有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用［5-6］。為此，我們推測(cè)MPA可能會(huì)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)影響，目前尚無MPA對(duì)人骨髓來源的間充質(zhì)細(xì)胞作用研究的報(bào)道。人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為一種重要的成體干細(xì)胞，在異基因造血干細(xì)胞移植中起著重要作用，研究MPA對(duì)MSCs的作用及機(jī)制，將為臨床合理應(yīng)用MPA和MSCs提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 骨髓MSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 骨髓細(xì)胞取材于骨髓捐獻(xiàn)志愿者，經(jīng)志愿者同意用于實(shí)驗(yàn)研究。在無菌條件下采集供者骨髓10 ml，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。以5×105個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種于10%FBS LGDMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。24～48 h后更換培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁匯合達(dá)80% ～90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)并標(biāo)記。取第3代 ～第6代細(xì)胞與 CD29-PE、CD166-PE、CD34-PE、CD14-FITC、CD44-FITC 和HLA-DR-FITC單克隆抗體(Beckman Coulter)孵育15 min，流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)其陽性率。

1.2 CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取第3代～第6代MSCs，以3×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度MPA(Roche)，每孔總體系 0.2 ml，分別處理 2 d、4 d、7 d，加 CCK-8(Dojindo)工作液20 μl/孔，置培養(yǎng)箱中孵育4 h。以630 nm波長(zhǎng)做為參比波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)復(fù)孔5個(gè)，取平均值為最終結(jié)果。計(jì)算細(xì)胞增殖率(P%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照祖OD值×100%。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs凋亡 MSCs以5×105/ml接種6孔培養(yǎng)板，分別加入不同終濃度霉酚酸，2 d和7 d后收獲細(xì)胞。收集1×106個(gè)細(xì)胞，參照Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cellquest 1.2分析軟件分析結(jié)果。

1.4 RT-PCR檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞IMPDH亞型的表達(dá)

1.4.1 RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄 用Trizol一步法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定 A260/A280值定量。用逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(Takara)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為10 μl，含有總RNA 2 μg，PrimeScriptTM RT Enzyme MixⅠ，Oligo dT Primer 2.5 μmol/L，Random 6 mers 5 μmol/L，反應(yīng)按說明書進(jìn)行。所得cDNA產(chǎn)物用于普通PCR反應(yīng)或real-time PCR。

1.4.2 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因 反應(yīng)總體系為 25 μl，包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1 μl，MgCl21.5 mmol/L，1 ×PCR 緩沖液，dNTP 0.5 mmol/L，目的基因或內(nèi)參照基因上、下游引物各0.25 μmol/L，Taq DNA合成酶1.0 U。PCR產(chǎn)物直接用于電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄。IMPDHⅠ的PCR 引物:上游 5＇-CAAGATCCTGGACCGTGT CA-3＇，下游 5＇-TGGCACTTTCTGTGGACATCA-3＇;產(chǎn)物 191 bp，反應(yīng)參數(shù):94℃ 35 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共 38 個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸 10 min。IMPDH 的 PCR引物:上游5＇-CAAGACATCTG GACCGTGTCA-3＇，下 游 5＇-CGCACTTTCTGTG GACATGCA-3＇;產(chǎn)物 180 bp，反應(yīng)參數(shù):93 ℃35 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s，共36 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。內(nèi)參照基因GAPDH的PCR引物:上游 5-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3，下游 5＇-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3，產(chǎn)物 219 bp，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。

1.5 MSCs體外誘導(dǎo)定向分化

1.5.1 MSCs體外誘導(dǎo)成骨分化 第3代～第6代MSCs按1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，生長(zhǎng)近70%后，更換培養(yǎng)液，加入成骨培養(yǎng)基(10%FBS的LG-DMEM含10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、0.25 mmol/L 抗壞血酸)，每隔3 d更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)分化第1天加終濃度為 1、10、50 和100 μmol/L 的霉酚酸，觀察對(duì)成骨分化的影響。

1.5.2 von Kossa染色鑒定細(xì)胞外鈣鹽沉積吸干培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定5 min，雙蒸水漂洗2次，自然晾干后，每孔加入2 ml新配制的2%硝酸銀溶液，去離子水充分洗滌，置于強(qiáng)光或紫外線下15～30 min，雙蒸水沖洗2次，鏡下染色觀察。

1.5.3 成骨分化鈣定量 以1×105/孔接種MSCs于6孔板，成骨誘導(dǎo)分化第14天，吸干培養(yǎng)液，每孔加0.5 mol/L HCl溶解鈣鹽，細(xì)胞刮刀刮去細(xì)胞，將細(xì)胞4℃振蕩4 h，1 000 g離心5 min，取上清用鈣定量試劑盒定量檢測(cè)鈣鹽，剩余細(xì)胞沉淀用BCA法定量檢測(cè)總蛋白，用鈣鹽定量的值除以總蛋白(單位為μg/mg)。

1.6 real-time PCR檢測(cè)目的基因 反應(yīng)在96孔 PCR板中進(jìn)行，反應(yīng)體系 20 μl，含 Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μl(Applied Biosystems)，引物 5 μl(上下游引物各 250 nmol/L)，cDNA 模板 5 μl。封口、離心后放入7 500 real-time PCR儀(Applied Biosystems)。反應(yīng)參數(shù)為95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。完成反應(yīng)后通過熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性。所得結(jié)果用系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行計(jì)算。用于real-time PCR的引物序列為:BMP-2上游 5＇-TAGACCTGTATCGCAGGCACTC-3＇，下游 5＇-TTCCCACTCGTTTCTGGTAGTTC-3＇;OP 上游 5＇-CTCAGGCCAGTTGCAGCC-3＇;下游 5＇-CA AAAGCAAATCACTGCAATTCTC-3＇;Runx2 上游5＇-CAGACCAGCAGCACTCCATA-3＇，下游 5＇-CA GCGTCAACACCATCATTC-3＇;OSX 上游 5＇-GCC AGAAGCTGTGAAACCTC-3＇，下 游 5＇-GCTGCA AGCTCTCCATAACC-3＇;ATF4 上游 5＇-CAGCCG CTTCACCTACAGC-3＇，下 游 5＇-CAGCCGCTTC ACCTACAGC-3＇。

1.7 Western-blot分析蛋白質(zhì)表達(dá) 細(xì)胞蛋白質(zhì)提取:收集5×105個(gè)細(xì)胞，離心、棄上清，用預(yù)冷PBS洗滌2次，加SDS細(xì)胞裂解液100 μl，反復(fù)吹打，置冰上，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理(160 w，持續(xù)3 s，間隔5 s，共 3 次)，4℃ 14 000 g/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度后，100℃煮樣5 min，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取100 μg的總蛋白樣本，經(jīng) 10%SDSPAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜印跡于 PVDF膜，含5%脫脂牛奶的TBST液體中封閉1 h，洗膜;而后加入一抗(Runx2和 Osterix多抗，Cell Signaling)，4℃過夜，洗膜，加入二抗溶液中，室溫溫育1 h，洗膜后加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)底物，曝光30 s～5 min，顯影、定影。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用 q檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型鑒定 第3代～第6代MSCs表達(dá)CD29、CD166、CD44，不表達(dá) CD34、CD14 和 HLA-DR，免疫表型符合MSCs(圖1)。

圖1 人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型鑒定Fig.1 The immunophenotype of human bone marrow-derived MSCs

2.2 MPA抑制骨髓來源MSCs的增殖 不同濃度MPA(1～100 μmol/L)與MSCs作用2 d～7 d，總體各濃度組的細(xì)胞增殖率均有顯著差異，F(xiàn)值分別為80.188、63.745和71.559，P 值均小于0.01。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物濃度的增加，其增殖率從(76.53±6.01)%降低到(15.4±6.87)% 。與正常對(duì)照組相比，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。在上述各MPA濃度組中添加鳥嘌呤核苷(100 μmol/L)，MSCs的增殖率得到恢復(fù)，與相應(yīng)MPA濃度組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

2.3 MPA對(duì)骨髓來源的MSCs無促進(jìn)凋亡的作用 圖4 顯示 10 μmol/L、100 μmol/L 的MPA分別作用于MSCs 2 d和7 d，凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(Annexin V陽性，即LR+UR象限)分別為(8.23±1.55)%、(7.67±0.70)%和(8.20±0.51)%、(10.03±2.99)%，與空白對(duì)照組(8.20±0.74)%和(7.43±1.38)%相仿(P＞0.05)，說明MPA不能促進(jìn)MSCs發(fā)生凋亡。

2.4 間充質(zhì)干細(xì)胞IMPDH亞型的檢測(cè) 采用RT-PCR方法檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞IMPDH亞型的表達(dá)，結(jié)果顯示MSCs表達(dá)IMPDH1、IMPDH2(圖5)。

2.5 霉酚酸對(duì)MSCs成骨分化的影響 von Kossa染色顯示，從10 μmol/L濃度開始 MSCs的成骨分化明顯減少，在100 μmol/L濃度下成骨分化基本消失(圖6)。Ca定量方法顯示MPA對(duì)MSCs成骨分化有劑量依賴性抑制作用(圖7)。Osteopontin(OP)和BMP-2是成骨細(xì)胞2個(gè)重要的標(biāo)志性基因，real-time PCR結(jié)果顯示二者的表達(dá)也呈劑量依賴性降低(圖8)。

為研究MPA抑制MSCs成骨分化的機(jī)制，本研究在各實(shí)驗(yàn)組中添加Guo，結(jié)果顯示抑制成骨分化的作用消失(圖7)。real-time PCR分析顯示，在MSCs成骨分化的第7天和第14天Runx2和OSX在MPA作用下表達(dá)均明顯降低，但ATF4表達(dá)無明顯改變(表1);Westernblot結(jié)果也證實(shí)Runx2和OSX表達(dá)降低，加入Guo后表達(dá)得到恢復(fù)(圖9)。

圖5 RT-PCR檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞IMPDH亞型的表達(dá)Fig.5 Expression of IMPDH subtype on MSCs identified by RT-PCR

3 討論

MPA是MMF在體內(nèi)代謝后的活性成分，所以本研究直接選擇MPA來研究其對(duì)MSCs的作用，臨床資料顯示MPA的血藥濃度范圍約為0.5～60 μmol/L，我們根據(jù)其血藥濃度選擇體外藥物實(shí)驗(yàn)的濃度范圍，以研究其作用機(jī)制［7-8］。

MPA在細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)是IMPDH酶，IMPDH酶是鳥嘌呤從頭合成途徑的限速酶，抑制該酶的活性可使鳥嘌呤核苷酸和脫氧鳥嘌呤核苷酸耗竭，進(jìn)而阻斷DNA和RNA的合成。次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)則是鳥嘌呤補(bǔ)救合成途徑的限速酶，它催化鳥苷形成鳥嘌呤核苷酸。該酶有兩種亞型，Ⅰ型酶表達(dá)于所有細(xì)胞，而Ⅱ型酶表達(dá)于部分細(xì)胞，與細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，IMPDHⅡ型對(duì)MPA的敏感性比Ⅰ型高5倍以上［9］。RT-PCR結(jié)果顯示MSCs表達(dá)IMPDHⅠ型和Ⅱ型酶，這一結(jié)果也解釋了MSCs之所以對(duì)MPA作用敏感的原因。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPA在1～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)，能使MSCs的增殖抑制呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。為進(jìn)一步探索MPA抑制MSCs增殖的機(jī)制，本研究首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了MPA對(duì)MSCs凋亡的影響，結(jié)果顯示MPA各濃度組在作用的2 d和7d，均未促進(jìn)MSCs的凋亡，這提示MPA不是通過凋亡途徑來抑制MSCs的增殖;添加鳥嘌呤核苷后MPA的抑制效應(yīng)逆轉(zhuǎn)，這表明 MPA是通過抑制IMPDH酶活性而發(fā)揮抑制效應(yīng)的。

圖6 MPA對(duì)MSCs成骨分化von Kossa染色的影響Fig.6 The effect of MPA on von Kossa stain of MSCs afer osteogenetic differentiation

表1 MPA(100 μmol/L)對(duì) Runx2、OSX 和ATF4表達(dá)的影響Table 1 EffectofMPA (100 μmol/L)on mRNA levels of Runx2，OSX and ATF4

圖9 MPA對(duì)Runx2和OSX蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of MPA on protein levels of Runx2 and OSX

MSCs是體內(nèi)一類重要的成體干細(xì)胞，可以定向分化為成骨細(xì)胞，在間質(zhì)組織更新和修復(fù)中起著重要作用;而Runx2、Osterix和ATF4這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在MSCs分化為成骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞特有基因的轉(zhuǎn)錄中具有重要作用［10］。本研究在探討MPA對(duì)MSCs成骨分化影響的實(shí)驗(yàn)中，von Kossa染色和鈣定量結(jié)果均表明MPA抑制MSCs的成骨分化，添加鳥嘌呤核苷后可以解除對(duì)MSCs成骨分化的抑制;采用real-time PCR方法對(duì)成骨分化途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix和ATF4進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Runx2和Osterix在分化過程中7 d和14 d 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均降低，而ATF4表達(dá)沒有改變，Western blot的結(jié)果也表明，Runx2和Osterix表達(dá)降低，加入鳥嘌呤核苷后二者表達(dá)得到恢復(fù)。這表明MPA通過耗竭鳥嘌呤核苷酸而影響Runx2和Osterix mRNA的表達(dá)，抑制Runx2和Osterix蛋白的合成，從而影響MSCs的成骨分化。

本研究發(fā)現(xiàn)，在血藥濃度范圍內(nèi)MPA對(duì)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化有劑量依賴性抑制作用，這一作用可能會(huì)影響MSCs發(fā)揮正常的生理功能及治療作用。因此，在保證MPA足夠治療作用的同時(shí)，減少M(fèi)PA的應(yīng)用劑量可能會(huì)減少M(fèi)PA的不良反應(yīng)，我們移植中心獨(dú)創(chuàng)性低劑量MMF的GVHD預(yù)防方案為解決這一問題提供了思路和寶貴的臨床經(jīng)驗(yàn)［11-12］。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅是重要的成體干細(xì)胞，由于其強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)特性己被應(yīng)用于臨床治療，與造血干細(xì)胞共移植以及用于治療移植后激素耐藥重度急性GVHD都顯示了良好的應(yīng)用前景，MSCs在臨床應(yīng)用中與免疫抑制劑的相互作用將是移植領(lǐng)域研究的一個(gè)新的方向。

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