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    芹菜素對肺癌細(xì)胞的抗增殖作用和抗腫瘤藥物的增敏作用

    2011-10-22 10:28:25任環(huán)宇唐修文
    關(guān)鍵詞:博來霉素奧沙利抗癌

    任環(huán)宇,唐修文

    (浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與遺傳學(xué)系,浙江杭州310058)

    芹菜素是一種低毒、非誘變性的黃酮類物質(zhì)[1],存在于許多水果和蔬菜(大白菜、青椒、大蒜、芹菜和番石榴等)中[2]。研究報(bào)道,芹菜素具有預(yù)防腫瘤的作用。在體外細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤模型中,其可以促進(jìn)金屬螯合,清除自由基以及激活Ⅱ相解毒酶[3];在鼠皮膚和結(jié)腸癌模型中證明,其具有保護(hù)組織對致癌物質(zhì)的侵襲[4-5]。芹菜素是鳥氨酸脫羧酶的強(qiáng)抑制劑,而該酶在腫瘤誘發(fā)中起關(guān)鍵作用,局部應(yīng)用芹菜素可以抑制二甲基苯并蒽誘導(dǎo)的皮膚癌[6]。芹菜素還可降低紫外線誘導(dǎo)的癌癥發(fā)生率[4]。在吸煙人群中,芹菜素等黃酮類化合物的攝入與肺癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[7]。據(jù)報(bào)道,芹菜素可抑制人宮頸癌hela細(xì)胞[8]、前列腺癌CA-HPV-10[9]細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的增殖,在體內(nèi)或體外抑制多種腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和侵襲[10-14],誘導(dǎo)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和白血病細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和凋亡[9,15-18]。芹菜素可抑制人類前列腺癌PC-3細(xì)胞、人類卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞以及乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞在動物模型中腫瘤的血管生成[10,14,19]。尤其是,芹菜素可以顯著地抑制前列腺癌CA-HPV-10細(xì)胞的生長,而對人類正常前列腺上皮細(xì)胞抑制作用很弱,表現(xiàn)出特異性抗腫瘤作用。類似的選擇性抑制效應(yīng)也被發(fā)現(xiàn)于人類鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞和人類正常表皮角質(zhì)化細(xì)胞中[9];并 且,芹 菜 素 可 增 強(qiáng) TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡,如人類急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞、人類前列腺癌DU145細(xì)胞和人類結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞,而對正常的人類外周血單核細(xì)胞無增強(qiáng)作用[2]。芹菜素也可以增強(qiáng)順鉑(cisplatin)對黑素瘤B16-BL6細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長的抑制作用[12]。因此,芹菜素不但自身具備抗腫瘤活性,并且與抗癌藥物聯(lián)用也表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果。

    肺癌作為癌癥最多發(fā)的形式,是世界范圍內(nèi)引起癌癥死亡最主要的病因之一[20]。肺癌的高致死率,一方面是由于缺乏有效的早期檢測手段,另一方面是腫瘤對許多治療處理產(chǎn)生了抗性[10]。芹菜素已被發(fā)現(xiàn)可以抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖以及在裸鼠中抑制其腫瘤生長和血管生成;并且,芹菜素可以通過半胱天冬酶和線粒體依賴通路(caspase-and mitochondria-dependent pathways)來誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌 A549 和 H460 的細(xì)胞凋亡[10,21-22]。本研究首次證明芹菜素可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性。這將對在非小細(xì)胞肺癌中提高抗腫瘤藥物的治療效果以及藥物的聯(lián)合治療起到一定的指導(dǎo)意義。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑 DMEM購自GIBCO,胰蛋白酶購自上海生工,新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司,抗生素antibioticantimycotic購自GIBCO。四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt;MTS]和吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)購自 Promega,二甲基亞砜(DMSO)、芹菜素 (apigenin)、博來霉素(bleomycin)和奧沙利鉑(oxaliplatin)購自Sigma。芹菜素用DMSO配制成50 mmol/L,博來霉素用DMSO配制成20 mmol/L,奧沙利鉑用5%葡萄糖配制成12.5 mmol/L,均于-20℃避光貯存。

    1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549、H460、LTEP-a2和 NCI-H292均購自上海生命科學(xué)研究院,細(xì)胞在含15%新生牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí),取對數(shù)生長期細(xì)胞,按所需細(xì)胞數(shù)量種板,細(xì)胞貼壁后加藥處理。

    1.2 方法

    1.2.1 臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù) 取對數(shù)生長期肺癌細(xì)胞,分別按1×104個(gè)/孔種24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板,過夜貼壁后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入含選定濃度(A549細(xì)胞用10 μmol/L和 20 μmol/L 2個(gè)濃度,其它細(xì)胞分別用30 μmol/L和50 μmol/L 2個(gè)濃度)芹菜素的 DMEM(含1%抗生素)培養(yǎng)基500 μl,根據(jù)孵育時(shí)間分3組:24 h、48 h和72 h組,每組3個(gè)復(fù)孔;到規(guī)定的孵育時(shí)間后,棄去培養(yǎng)基,每孔用150 μl胰酶消化,并用等體積的培養(yǎng)基終止,吹成均勻細(xì)胞懸液;然后,取部分懸液臺盼藍(lán)染色,在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算活細(xì)胞數(shù)。

    1.2.2 MTS法檢測抗癌藥物的抗細(xì)胞增殖作用 取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞,按1×104個(gè)/孔種96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板,貼壁后棄去培養(yǎng)基,試驗(yàn)組每孔加入不同濃度(A549細(xì)胞中10 μmol/L,H460 細(xì)胞中50 μmol/L,LTEP-a2 細(xì)胞中30 μmol/L,H292 細(xì)胞中20 μmol/L)芹菜素的DMEM(含1%抗生素)培養(yǎng)基 200 μl,并設(shè)不加藥空白和加DMSO的對照組,過夜處理后,棄去培養(yǎng)基,用1×PBS洗1遍。然后,用含1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋配制不同濃度的博來霉素和奧沙利鉑,設(shè)不加藥空白對照組和DMSO對照組,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每孔200 μl藥液處理,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h終止,加入MTS/PMS混合液(DPBS∶MTS∶PMS=10∶10∶1)40 μl/孔,再于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5~1 h后,用全波長酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測OD值。

    其中,D代表濃度,Dm代表半數(shù)抑制濃度,fa代表抑制率;

    其中,(D)1和(D)2分別代表兩種藥物聯(lián)用時(shí)各自的濃度,x代表其聯(lián)用產(chǎn)生的抑制率。(Dx)1和(Dx)2則表示達(dá)到聯(lián)用相同抑制效果所需的其中任何一種藥物的濃度,需要分別由公式(1)進(jìn)行計(jì)算得出。CI=1代表積和作用,CI<1代表協(xié)同作用,CI>1代表拮抗作用。

    2 結(jié)果

    2.1 芹菜素抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用 4種肺癌細(xì)胞分別選用2個(gè)濃度的芹菜素孵育24 h、48 h和72 h,然后用血小板計(jì)數(shù)器分別計(jì)算芹菜素處理后的細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表明,芹菜素能抑制4種肺癌細(xì)胞的增殖(圖1),并且這種增殖抑制作用呈一定的劑量效應(yīng)。在24 h、48 h和72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn),10 μmol/L的芹菜素使A549細(xì)胞的增殖分別被抑制到對照組的77%、45%和82%;而30 μmol/L的芹菜素,使H460細(xì)胞的增殖分別被抑制到對照組的81%、85%和37%,使LTEP-a2細(xì)胞的增殖分別被抑制到對照組的48%、65%和66%,使H292細(xì)胞的增殖分別被抑制到對照組的44%、49%和63%。

    2.2 芹菜素增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性 為避免芹菜素自身毒性過大,干擾增敏實(shí)驗(yàn),本研究在 A549、H460、LTEP-a2和 H292細(xì)胞聯(lián)合用藥的芹菜素濃度分別選定為10 μmol/L、50 μmol/L、30 μmol/L 和 20 μmol/L(圖2A、B)。經(jīng)公式(1)和公式(2)分別計(jì)算出奧沙利鉑和博來霉素在上述4種肺癌細(xì)胞聯(lián)用前后的IC50值(圖2),以及芹菜素分別與奧沙利鉑和博來霉素聯(lián)用時(shí)每個(gè)濃度點(diǎn)的CI值(表1和表2)。圖2C-F示芹菜素能增加抗癌藥物奧沙利鉑和博來霉素的毒性,芹菜素過夜預(yù)處理使得每實(shí)驗(yàn)組抗癌藥物的IC50值都顯著下降。在A549細(xì)胞中,博來霉素的IC50值由94.91 μmol/L 降至 12.46 μmol/L,奧沙利鉑的IC50值由115.87 μmol/L 降至 60.59 μmol/L;在H460細(xì)胞中,博來霉素的 IC50值由250.36 μmol/L 降至 14.71 μmol/L,奧沙利鉑的 IC50值由1 177.91 μmol/L 降 至 27.55 μmol/L;在LTEP-a2細(xì)胞中,博來霉素的IC50值由1 075.30 μmol/L 降至140.09 μmol/L,奧沙利鉑的 IC50值由22.54 μmol/L 降至 5.11 μmol/L;在 H292 細(xì)胞中,博來霉素的IC50值由144.95 μmol/L降至57.43 μmol/L,奧 沙 利鉑的 IC50值 由 95.60 μmol/L降至55.86 μmol/L。再者,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的芹菜素與抗癌藥物在每個(gè)濃度處的聯(lián)合作用指數(shù)(CI值)絕大多數(shù)都小于1(表1、表2)。這提示芹菜素能很好地增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性,與抗癌藥物有協(xié)同作用。

    圖1 芹菜素抑制肺癌細(xì)胞的增殖Fig.1 The proliferation of lung cancer cells suppressed by apigenin

    表1 芹菜素在肺癌細(xì)胞中與奧沙利鉑聯(lián)用的CI值Table 1 Analysis of combined treatment of apigenin with oxaliplatin in lung cancer cells combination index

    圖2 芹菜素對4種肺癌細(xì)胞的毒性以及增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性Fig.2 The increased susceptibility oflung cancercellsby apigenin to antitumor drugs

    3 討論

    Abate等人發(fā)現(xiàn)芹菜素在鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中可以抑制氯化血紅素(hemin)誘導(dǎo)的 HO-1蛋白水平和mRNA 表達(dá)[25],而 Kim 等指出,在肺癌細(xì)胞中,Nrf2-HO-1信號通路與癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性密切相關(guān),利用HO-1小干擾RNA或ZnPPIX抑制HO-1的表達(dá),可增強(qiáng)A549細(xì)胞對順鉑的敏感性[26]。除HO-1外,其它由Nrf2信號通路調(diào)控的下游基因,如Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶及藥物流出泵等的表達(dá)也與腫瘤耐藥性相關(guān)[27]。另外,Nrf2 信號通路也被證明可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平[28],而細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽平衡及谷胱甘肽依賴的酶在腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的耐藥性方面起關(guān)鍵作用[29]。最近,辛愛等通過在人肺癌H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Nrf2-shRNA建立的Nrf2降表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株,與對照組相比,谷胱甘肽水平顯著減低,奧沙利鉑的細(xì)胞毒性顯著增加[30]。而之前,Kachadourian等報(bào)道,在A549細(xì)胞和人類前列腺癌PC-3細(xì)胞中,芹菜素可以顯著降低谷胱甘肽水平[31],因此,我們推測芹菜素很有可能通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽水平來增敏肺癌細(xì)胞,而且此過程可能與 Nrf2信號通路有關(guān)。

    總之,本研究證實(shí)了芹菜素在肺癌細(xì)胞中具有廣泛的抗增殖作用,尤其是可以增敏肺癌細(xì)胞,提高抗癌藥物的效果。這提示芹菜素將在今后的肺癌臨床治療中具有廣闊的前景,其在體內(nèi)應(yīng)用的安全性及毒副反應(yīng)有待進(jìn)一步的研究。

    表2 芹菜素在肺癌細(xì)胞中與博來霉素聯(lián)用的CI值Table 2 Analysis of combined treatment of apigenin with bleomycin in lung cancer cells:combination index

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