中藥藤黃呫噸酮類化合物及其分析測定方法

崔洪英， 柳文媛， 王 磊， 馮 鋒*

(1.中國藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室，江蘇 南京 210009;2.中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京 210009;3.藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

中藥藤黃系藤黃科植物藤黃(Garcinia hanburyi Hook.f.)所分泌的樹脂干燥物，市售藤黃呈圓柱狀或不規(guī)則塊狀，色黃，質(zhì)脆易碎。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，藤黃味苦澀、有毒，具有攻毒、蝕瘡和破血散節(jié)等功效，主治癰疽、腫毒、頑癬、惡瘡和跌打損傷等疾?。?］。藤黃中含有以藤黃酸(gambogic acid，1)為代表的籠狀噸酮類(caged xanthone)化合物，藥理研究表明，該類成分多具有廣譜強(qiáng)效的抗腫瘤活性［2］。因此，對藤黃中噸酮類化合物的分離和分析一直是藤黃研究的重點(diǎn)。近年來，研究人員從藤黃中分離得到數(shù)十種籠狀噸酮類成分，其中很多化合物還存在順反異構(gòu)體和旋光異構(gòu)體，因此亟待建立能全面反映藤黃化學(xué)成分，特別是噸酮類成分的分離分析方法，從而更好地對藤黃及相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。同時，對各種異構(gòu)體單體的分離、鑒定及定量檢測對其抗腫瘤機(jī)制的深入研究也具有重要意義。本文對近年來從中藥藤黃中分離的噸酮類化合物進(jìn)行了匯總，并介紹了相關(guān)分離分析方法，旨在為中藥藤黃的質(zhì)量控制和噸酮類化合物作用機(jī)制的深入研究提供參考。

1 藤黃中的呫噸酮類化合物

1.1 含A環(huán)的籠狀呫噸酮類化合物

1.2 無A環(huán)的籠狀呫噸酮類化合物

1.3 無籠狀橋環(huán)的呫噸酮類化合物

2 藤黃中呫噸酮類化合物的含量測定方法

2.1 高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法

蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)為一種通用型檢測器，可檢測揮發(fā)性低于流動相的任何樣品，樣品無需含有發(fā)色基團(tuán)，該法現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于碳水化合物、類脂、脂肪酸、氨基酸及藥物等的檢測。楊虹等(中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999年)建立了測定藤黃中藤黃酸和新藤黃酸含量的HPLC-蒸發(fā)光散射法，色譜條件為:以 Alltima C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)為固定相，甲醇－己腈－水－冰乙酸(體積比為6∶1∶2∶0.3)為流動相，流速為0.8 mL·min－1，等度洗脫，色譜柱柱溫為25℃，檢測器漂移管溫度為75℃，恒定氣體壓力為2.1 L·min－1。在此條件下，新藤黃酸和藤黃酸的保留時間分別為24.5和36.8 min，兩者分離度良好(R＞1.5)。該方法準(zhǔn)確度較高，對5種市售藤黃進(jìn)行測定，藤黃酸含量為22.75%～34.58%，新藤黃酸含量為12.75% ～21.79%，回收率均在95%以上。

2.2 高效液相色譜－紫外分光光度法

長期以來，文獻(xiàn)報(bào)道的藤黃成分分析研究主要是針對其主成分藤黃酸和新藤黃酸進(jìn)行的定性和定量分析［19-22］，而極少有對藤黃中多種籠狀噸酮類成分同時進(jìn)行分析的報(bào)道，更無對其中順反異構(gòu)體進(jìn)行分離和分析的方法。2006年，韓全斌等［23］首次建立了分析藤黃中籠狀噸酮類成分順反異構(gòu)體的HPLC-UV法，選用 Alltima C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為固定相，乙腈-0.1%三氟乙酸(體積比為9∶1)為流動相，流速1.0 mL·min－1，等度洗脫，檢測波長為360 nm，分析了來源于中國和印度的藤黃共7種。結(jié)果顯示，這7種藤黃的HPLC圖譜類似，且其共有的7種籠狀噸酮類化合物均為主成分，包括3對順反異構(gòu)體(藤黃酸和異藤黃酸、莫里林酸和異莫里林酸以及gambogenic acid和isogambogenic acid)與30-羥甲基藤黃酸。在上述色譜條件下，7種化合物色譜峰分離度良好(R＞1.5)，藥材中其他6個化合物與異藤黃酸相比，其色譜相對保留時間恒定(RSD均小于0.85%)，故該法可作為藤黃HPLC指紋圖譜的特征峰用于藥材的真?zhèn)舞b別。

2.3 高效液相色譜－質(zhì)譜法

HPLC-UV法和HPLC-蒸發(fā)光散射法主要用于定性和定量分析已獲得單體的籠狀噸酮類化合物。藤黃中籠狀噸酮類化合物分子間結(jié)構(gòu)相近，其主要區(qū)別在于取代基的種類和位置，異戊烯基雙鍵兩側(cè)取代基不同所形成的順反異構(gòu)，以及C2位手性碳原子形成的旋光異構(gòu)，故而分離和分析的難度較高。利用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)則無需分離出化合物單體，就能推測出藤黃中籠狀噸酮類化合物的結(jié)構(gòu)。由于噸酮類成分大多具有相同的噸酮母核，其質(zhì)譜裂解過程具有一定規(guī)律性［26］:籠狀噸酮在碰撞誘導(dǎo)解離(CID)過程中C9和C10位可發(fā)生逆Diels-Alder(RDA)裂解，橋環(huán)開裂失去質(zhì)荷比(m/z)為84或86的碎片，簡單噸酮類化合物無此裂解行為，據(jù)此可判斷待測化合物是否為籠狀噸酮;籠狀噸酮分子在裂解過程中會產(chǎn)生相繼丟失C4H8(m/z為56)或C9H16(m/z為124)的碎片離子，由此可判斷分子中異戊烯基的個數(shù)。此外，順反異構(gòu)體裂解方式不同，藤黃酸和異藤黃酸具有相同的分子離子峰(m/z為629.3114)和一級MS圖譜，但二級MS裂解過程有差異:異藤黃酸C13位異戊烯基側(cè)鏈裂解時，C27位氫原子可遷移至C12位羰基上發(fā)生McLafferty重排，丟失C13位異戊烯基側(cè)鏈后產(chǎn)生m/z為447.2166的碎片;藤黃酸分子中C27和C28位間雙鍵為Z式構(gòu)型，使得C27位氫原子不能遷移至C12位羰基上，故而無McLafferty重排。因此，通過觀察有無m/z為447.2166的離子峰可判斷化合物的順反異構(gòu)。

3 結(jié)語

文獻(xiàn)報(bào)道的藤黃中大多數(shù)成分的色譜圖均相似［23，25，27，29］，但對于藤黃中另一主成分(見圖 1，其色譜峰編號為5)的鑒定，目前尚存在一定爭議。韓全斌等［23］認(rèn)為該化合物為 gambogenic acid(42)，但周安等［27］認(rèn)為是新藤黃酸(26)。筆者按照呂歸寶等(藥學(xué)學(xué)報(bào)，1984年)報(bào)道的方法制備了該化合物，然后通過色譜峰比對及NMR數(shù)據(jù)測定，發(fā)現(xiàn)該化合物的NMR數(shù)據(jù)與gambogenic acid的NMR數(shù)據(jù)［2］基本一致，由此認(rèn)為部分文獻(xiàn)中所述的新藤黃酸應(yīng)更正為gambogenic acid。

圖1 藤黃中化學(xué)成分的HPLC圖譜Figure 1 HPLC chromatogram for the compounds in gamboge

目前臨床應(yīng)用的抗腫瘤藥物多為化學(xué)合成產(chǎn)物，普遍存在毒副作用較大、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)。因此，尋找高效低毒的新型化合物一直是抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)。中藥藤黃可通過多種機(jī)制達(dá)到抗腫瘤效果，是一種多靶點(diǎn)的抗腫瘤天然藥物。值得注意的是，中藥藤黃與一般化療藥物的明顯區(qū)別在于其能選擇性殺死腫瘤細(xì)胞，而對正常造血系統(tǒng)無影響(陳葆仁，江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1980年)，故而具有較高安全性;其主要成分藤黃酸極具開發(fā)前景，目前該化合物的Ⅱ期臨床研究已在進(jìn)行中。近來國內(nèi)外有關(guān)藤黃中噸酮類化合物的分離、分析及其活性研究的報(bào)道越來越多，筆者所在課題組也正在從事對藤黃中噸酮類化合物進(jìn)行分離和分析的研究工作，現(xiàn)已分離得到10余種籠狀噸酮類成分，并計(jì)劃對其中多對異構(gòu)體進(jìn)行抗腫瘤活性初篩，以考察這些異構(gòu)體尤其是C2位旋光異構(gòu)體間的活性差異，為噸酮類化合物的進(jìn)一步研究及藤黃中其他有效成分的探索提供參考。

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