復方參芪五味咀嚼片微生物限度檢查的方法驗證

何 進，史國兵，高 軍，楊曉東(.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，遼寧 沈陽 0840;.大連醫(yī)科大學臨床藥學，遼寧 大連 607)

復方參芪五味咀嚼片是在原生脈飲的基礎上，增加黃芪制成的新型中藥復方口服制劑 ，由黃芪、人參、五味子、麥冬等中藥材組成，具有提高機體免疫力，抗疲勞等功效。按照中國藥典(2010年版)一部附錄相關要求，要進行微生物限度檢查。筆者主要對復方參芪五味咀嚼片的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法，及控制菌大腸埃希菌的檢查方法進行驗證，以建立適合于該制劑的微生物限度檢查方法，為制劑進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥品和培養(yǎng)基 復方參芪五味咀嚼片(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，批號 090925，091029，091030);0.9%氯化鈉注射液(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，2008022207)。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號070104);營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號071008);玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號080216);改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號070426);膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基(批號070517);4-甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基(批號070604);蛋白胨(批號070712);均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.2 菌株 大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(B)98001］和黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(B)98003］，均為第3代菌株，購自遼寧省藥檢所。

1.3 儀器 ZF-Ⅰ型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠);NC303-4A電熱恒溫培養(yǎng)箱和NC303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱(南京長江儀器廠);YX280B手提式不銹鋼消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)。

2 方法和結果

2.1 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的制備 取磷酸二氫鉀 3.56 g、磷酸氫二鈉 7.23 g、氯化鈉 4.30 g、蛋白胨 1.0 g，加水 1 000 ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。

2.2 供試液的制備 取復方參芪五味咀嚼片10 g，置滅菌乳缽研成粉末，加適量pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液研勻并轉(zhuǎn)移到滅菌燒瓶中，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，在45℃恒溫水浴中保溫震蕩混勻，制成1∶10倍的供試液。

2.3 菌液制備 分別取經(jīng)35℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物，以及經(jīng)25℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋成每1 ml含菌數(shù)50～100 cfu的菌懸液;取經(jīng)25℃培養(yǎng)5 d的黑曲霉新鮮培養(yǎng)物，用5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋成每1 ml含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液。以上各菌懸液或孢子懸液同時各取2份注入瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用平皿計數(shù)法計數(shù)，結果見表1。

2.4 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證

2.4.1 驗證方法與結果 ①試驗組:采用平皿法，取1:10供試液及50～100 cfu/ml/試驗菌各1 ml，依次加入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養(yǎng)基20 ml，每株試驗菌平行制備2個平皿，待凝固后，按規(guī)定溫度培養(yǎng)48～72 h，按菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)，進行3次的獨立平行試驗，并分別計算試驗組和稀釋劑對照組的菌回收率。依據(jù)《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查方法進行判定。結果見表2。②菌液組:測定所加的試驗菌數(shù)。③供試品對照組:取規(guī)定量1:10供試液，按菌落計數(shù)方法測定樣品本底菌數(shù)。結果均未見菌生長。④稀釋劑對照組:取稀釋液10 ml，同試驗組方法測定菌數(shù)。結果5種試驗菌回收率均大于70%。

表2 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法回收率結果(%，n=3)

2.4.2 樣品細菌、霉菌或酵母菌計數(shù)檢查 取3批樣品各10 g，分別用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml制成1:10的供試液。取1∶10供試液10 ml，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，制成1∶100的供試液。再取1∶100供試液10 ml，加pH 7.0無菌氯化鈉(蛋白胨緩沖液至100 ml，制成1∶1 000的供試液。取3批樣品各稀釋級供試液各1 ml分別注入無菌平皿中，然后傾入20 ml冷至45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(細菌計數(shù))，另取1∶10和1∶100供試液各1 ml分別置無菌平皿中，傾入20 ml冷至45℃的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(霉菌、酵母菌計數(shù))，混勻，凝固后倒置于特定溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時間為48 h;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)時間為72 h)。每個稀釋級的供試液平行作2份;另取稀釋液1 ml作陰性對照。結果表明，3批樣品按驗證方法檢查，細菌、霉菌或酵母菌總數(shù)均＜10 cfu/ml，均符合規(guī)定。

2.5 控制菌檢查方法的驗證

2.5.1 菌種選擇 復方參芪五味咀嚼片為中藥口服固體制劑，不含生藥原粉，按照2010年版《中華人民共和國藥典》一部附錄微生物限度檢查法中的有關控制菌檢查方法，應檢查大腸埃希菌。

2.5.2 菌液和供試液的制備 菌液按2.3項下方法制備，菌數(shù)控制在10～100 cfu/ml。供試液按2.2項下方法制備。

2.5.3 驗證方法與結果 取100 ml膽鹽乳糖(BL)培養(yǎng)基6份，2份分別加入l0 ml供試液及1 ml 10～100 cfu大腸埃希菌懸液作為實驗組，2份分別加入1ml 10～100 cfu大腸埃希菌懸液作為陽性對照組，2份分別加入稀釋劑10 ml作為陰性對照組，均在35～37℃培養(yǎng)18～24 h。取上述各培養(yǎng)物0.2 ml，接種至含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24 h在366 nm紫外光下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照，依據(jù)《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查方法進行判定，結果見表3。

表3 控制菌檢查法驗證結果

結果顯示，控制菌檢查陽性菌生長良好，陰性對照無菌生長。

2.5.4 樣品控制菌檢查 取3批樣品1∶10的供試液各10 ml，分別接種至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 ml中;另取大腸埃希菌的10～100 cfu/ml菌懸液1 ml、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml分別接種至同樣培養(yǎng)基中作為陽性對照和陰性對照。按“2.5.3”項下方法操作，結果見表4。

表4 樣品控制菌檢查結果

結果表明，3批樣品按驗證方法檢查，陽性對照檢出大腸埃希菌，樣品均未檢出大腸埃希菌，陰性對照未見菌生長，結果符合規(guī)定。

3 討論

3.1 方法驗證 復方參芪五味咀嚼片采用常規(guī)法進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證時，5種試驗菌回收率均大于70%，表明本品對細菌、霉菌和酵母菌無抑制作用，可用常規(guī)法進行細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)檢查。

3.2 菌液制備 細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)中菌液的制備尤為重要。菌液含菌數(shù)過多或過少，在回收率測定時誤差都會增大。因此需要通過反復多次試驗，摸索出接種環(huán)刮取菌苔的量及稀釋菌液的經(jīng)驗方法，在菌液制備好時，同時進行活菌計數(shù)和供試品的方法驗證，才能將菌數(shù)控制在50～100 cfu/ml之間，而且在進行3次獨立平行試驗時，3次試驗的菌原液濃度應盡量一致，除黑曲霉孢子懸液外其他試驗菌菌懸液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，這樣才能保證驗證結果準確可靠。

［1］中國藥典.2010 年版.一部［S］.2010:附錄 XIII C:79 ～88.

［2］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:351～368.