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    小鼠對(duì)雨蛙肽誘發(fā)急性胰腺炎易感性的品系差異*

    2011-08-02 07:39:02張化宇王宇輝蔣孟茜韓迎春劉國(guó)慶
    中國(guó)病理生理雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:雨蛙脂肪酶品系

    張化宇, 唐 寅, 常 青, 劉 璐,王宇輝, 蔣孟茜, 韓迎春, 祁 榮△, 劉國(guó)慶△

    (北京大學(xué)1心血管研究所,2分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,3病理學(xué)系,北京 100191)

    急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是由于胰腺分泌的消化酶自我消化胰腺及其周圍組織而導(dǎo)致的嚴(yán)重的急性炎癥反應(yīng),并可能繼發(fā)一系列的多器官功能障礙,是臨床上危急重癥中較難治療的疾病之一[1]。

    雨蛙肽(caerulein)是膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)的類似物,小鼠腹腔過量給予雨蛙肽刺激,可以引起類似于人類急性胰腺炎疾病時(shí)的生化及病理生理改變。因此,雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠模型對(duì)臨床研究急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制、病理過程、診斷及藥物干預(yù)治療效果等方面有重要意義[2,3]。近年來,用于雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎模型小鼠的品系主要涉及 C57BL/6J[4,5]、BALB/c[6,7]和 ICR[8,9]3種。然而,多項(xiàng)研究報(bào)告有不同的結(jié)果,表明不同品系的小鼠對(duì)雨蛙肽誘發(fā)的胰腺炎可能有不同的敏感性,但目前尚缺乏對(duì)這種品系間差異的系統(tǒng)研究。而實(shí)際上,小鼠品系的差別在疾病模型制備中是非常重要的。動(dòng)脈硬化[10-12]、肥胖和糖尿?。?3,14]等均如此。本研究以血液生化學(xué)、胰腺病理學(xué)和胰腺炎性因子表達(dá)水平為指標(biāo),研究C57BL/6J、BALB/c和ICR 3種不同品系的小鼠對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎易感性的差異。

    材料和方法

    1 動(dòng)物

    2月齡雌性C57BL/6J、BALB/c和ICR小鼠,體重約20 g,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。所有小鼠均在12 h光照、12 h黑暗的標(biāo)準(zhǔn)周期下,于無菌設(shè)備中飼養(yǎng),自由進(jìn)食及飲水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    2 主要試劑

    Caerulein和DEPC購(gòu)自 Sigma。α淀粉酶和脂肪酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京中生北控生物科技股份有限公司。動(dòng)物組織總RNA Trizol提取液購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。Reverse Transcript Kit購(gòu)自Fermentas。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

    3 主要方法

    3.1 急性胰腺炎小鼠模型 C57BL/6J、BALB/c和ICR 3種品系的小鼠各12只,隨機(jī)分為2組,即實(shí)驗(yàn)組(n=6)與對(duì)照組(n=6)。各組小鼠自由飲水條件下禁食12 h。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射caerulein的生理鹽水溶液(50 μg/kg),每小時(shí)1次,連續(xù)注射7次。對(duì)照組小鼠同法腹腔注射生理鹽水。于第1次腹腔注射后的 0、3、6、9、12、24 h,對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行眶靜脈取血,肝素抗凝,離心分離血漿,試劑盒測(cè)定血漿淀粉酶和脂肪酶活性。第1次注射24 h后處死小鼠,取胰腺組織,分別用于病理學(xué)及炎癥因子表達(dá)的研究。

    3.2 胰腺組織病理學(xué)評(píng)分 對(duì)24 h取得的各組小鼠胰腺組織進(jìn)行福爾馬林緩沖液固定、石蠟包埋和切片。切片進(jìn)行 HE染色。按照病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15,16](表 1),對(duì)各胰腺組織的切片進(jìn)行雙人、雙盲的病理評(píng)分。對(duì)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    表1 胰腺炎癥損傷病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1.The standards of pathological scoring to the injury extent of pancreas

    3.3 胰腺組織炎癥因子表達(dá)測(cè)定 取小鼠胰腺組織約50 mg,于2 mL RNA Trizol提取液中勻漿,提取胰腺組織總RNA。利用Fermentas Reverse Transcript試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR)測(cè)定各胰腺組織中的 IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 和TGF-β1炎癥因子mRNA表達(dá)水平。每個(gè)樣品重復(fù)3次,并以SYBR Green作為熒光劑,結(jié)果以18S rRNA的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 血漿淀粉酶和脂肪酶的變化

    實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠在誘導(dǎo)急性胰腺炎的0、3、6、9、12和24 h的血漿淀粉酶和脂肪酶活性見圖1。與對(duì)照組正常小鼠相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠在雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎后,其血漿淀粉酶和脂肪酶水平均有明顯升高,并在9-12h達(dá)到峰值。3種品系的實(shí)驗(yàn)組小鼠在誘導(dǎo)急性胰腺炎后,BALB/c和ICR小鼠的血漿淀粉酶水平較C57BL/6J小鼠有更顯著的升高,見圖1A;BALB/c小鼠的脂肪酶峰值水平顯著高于C57BL/6J和ICR小鼠,見圖1B。以上結(jié)果表明,BALB/c和ICR小鼠在雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎后,其血漿生化學(xué)指標(biāo)(淀粉酶和脂肪酶)較C57BL/6J小鼠有更顯著的改變。

    Figure 1.Plasma α - amylase and lipase activity of C57BL/6J,BALB/c and ICR mice.BALB/c and ICR mice showed more dramatic increase of plasma α-amylase activity(A)and lipase activity(B)than those in C57BL/6J mice.*P <0.05,**P <0.01 vs C57BL/6J mice;△P <0.05,△△P <0.01 vs ICR mice.圖1 C57BL/6J、BALB/c和ICR小鼠血漿淀粉酶和脂肪酶的活性測(cè)定

    2 胰腺病理學(xué)變化

    3種品系小鼠的胰腺病理切片見圖2。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠的胰腺均有明顯的水腫改變。胰腺組織顯示小葉間隙增寬、結(jié)構(gòu)紊亂,腺泡細(xì)胞局限性或廣泛性壞死,小葉間及壞死灶內(nèi)均有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),見圖2A;而對(duì)照組小鼠胰腺形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)完好,無炎癥改變,見圖2A。

    Figure 2.Morphology and pathological scores of pancreatic tissues.A:HE staining of the pancreatic tissues(×200,scale bar 100 μm)from control and AP - induced groups of each mouse strain.Compared with the integrated and normal morphology in control groups,representative sections from AP-induced groups showed obvious pathological changes.B:pathological severity evaluation of the pancreatic tissues in terms of edema,inflammation cells,hemorrhage and necrosis.Pathological scoring was determined according to the standards described in Table 1.C:total pathological scores of the pancreatic tissues from each mouse strain.Compared with BALB/c and ICR mice,the pancreata of C57BL/6J mice showed milder pathological changes after AP induction.*P < 0.05,** P <0.01 vs C57BL/6J mice;#P <0.05 vs BALB/c mice.圖2 胰腺組織病理形態(tài)學(xué)研究及病理評(píng)分

    對(duì)C57BL/6J、BALB/c和ICR實(shí)驗(yàn)組小鼠的胰腺切片進(jìn)行病理評(píng)分,結(jié)果顯示,BALB/c小鼠胰腺的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)在3種品系的小鼠中最為嚴(yán)重,見圖2B;BALB/c和ICR小鼠胰腺的水腫程度顯著高于C57BL/6J小鼠,見圖2B。對(duì)水腫、壞死、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和出血4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行總評(píng)分,C57BL/6J小鼠的病理總評(píng)分顯著低于BALB/c和ICR小鼠,見圖2C。結(jié)果表明,在雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎情況下,C57BL/6J小鼠胰腺病理形態(tài)學(xué)的改變較BALB/c和ICR小鼠更輕。

    3 胰腺組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平的定量比較

    我們對(duì)3種品系的實(shí)驗(yàn)組小鼠胰腺組織中的炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 和 TGF-β1mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析,以評(píng)估其胰腺局部炎癥的嚴(yán)重程度。結(jié)果如圖3所示:ICR小鼠胰腺組織中的促炎因子IL-1β表達(dá)顯著高于C57BL/6J和BALB/c小鼠,見圖3A;TNF-α表達(dá)水平從高到低分別為ICR>BALB/c>C57BL/6J,見圖3D;IL-6、TGF-β1以及炎癥抑制因子IL-10表達(dá)水平在3種品系的小鼠間無顯著差異,見圖3B-E。結(jié)果表明,在雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎的病程中,C57BL/6J小鼠的炎癥因子表達(dá)水平較ICR和BALB/c小鼠低。

    Figure 3.The expression of inflammatory factors in pancreatic tissues after AP induction.Total RNA was isolated from 50 mg pancreatic tissues,and the expression of IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α and TGF-β1was quantified by real-time PCR with SYBR Green.The results were normalized by‘housekeeping’18S rRNA.The expression of IL-1β and TNF-α in the pancreata of ICR mice was more higher than that in BALB/c and C57 BL/6J mice,and BALB/c mice also showed higher TNF - α expression than C57BL/6J mice.*P <0.05 vs C57BL/6J;#P <0.05 vs BALB/c mice.圖3 胰腺組織炎癥因子表達(dá)水平

    討 論

    急性胰腺炎是臨床危重病癥之一,但在疾病的診斷和治療上仍缺乏有效手段。目前,血漿淀粉酶和脂肪酶水平仍是臨床上常用的診斷胰腺炎及其嚴(yán)重程度的特異性指標(biāo);胰腺的病理形態(tài)學(xué)改變也為胰腺炎的診斷和治療提供更為直接有力的證據(jù)。

    本研究通過采用雨蛙肽對(duì) C57BL/6J、BALB/c和ICR 3種不同品系的小鼠誘導(dǎo)急性胰腺炎,表明小鼠品系的差異對(duì)急性胰腺炎造模效果有明顯影響。其中,BALB/c小鼠的血漿酶學(xué)指標(biāo)、胰腺病理學(xué)改變及TNF-α表達(dá)水平方面顯著高于C57BL/6J小鼠;而ICR小鼠在急性胰腺炎誘導(dǎo)中的血漿淀粉酶水平和IL-1β、TNF-α表達(dá)水平顯著高于C57BL/6J小鼠。因此,與其它 2種品系的小鼠相比,C57BL/6J小鼠在急性期血漿胰腺酶學(xué)指標(biāo)、胰腺病理學(xué)改變及胰腺組織炎癥因子表達(dá)水平上,都顯示了對(duì)雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎較低的敏感性。

    正是基于對(duì)急性胰腺炎小鼠模型的研究,人們對(duì)急性胰腺炎的病理改變特征和炎癥因子表達(dá)上調(diào)、氧自由基損傷及鈣離子內(nèi)流異常等機(jī)制方面有了更深入的了解。我們的研究將為急性胰腺炎疾病的臨床診斷、治療和研究提供幫助。

    此外,對(duì)于急性胰腺炎易感因素及其機(jī)制的研究還有賴于基因修飾小鼠。在建立基因修飾小鼠模型時(shí),小鼠品系的選擇也至關(guān)重要。常用于代謝實(shí)驗(yàn)研究的C57BL/6J小鼠,因其對(duì)雨蛙肽誘發(fā)的胰腺炎易感性較低,可用于研究胰腺炎的促進(jìn)因子;而BALB/c、ICR小鼠的高易感性,將對(duì)研究胰腺炎的保護(hù)因素有價(jià)值。我們的研究結(jié)果將為急性胰腺炎研究中基因修飾小鼠的模型建立時(shí)如何選擇合適的小鼠品系提供理論支持。

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