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    卵巢上皮癌中血管生成擬態(tài)和E-鈣黏蛋白表達(dá)及其臨床意義

    2011-08-02 07:38:58武世伍宋文慶承澤農(nóng)
    中國(guó)病理生理雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:卵巢癌上皮生存率

    俞 嵐, 武世伍, 宋文慶, 周 蕾, 承澤農(nóng)

    (蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科,安徽省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 蚌埠 233030)

    卵巢癌是女性生殖道惡性腫瘤中死亡率最高的一種,70%的患者就診時(shí)已屬晚期,5年生存率低于30%。腫瘤血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)指的是在沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞的參與下,細(xì)胞表型出現(xiàn)轉(zhuǎn)化,通過(guò)自身變形和基質(zhì)重塑而直接形成特有的微循環(huán)管道,通道內(nèi)無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆。擬態(tài)血管生成使卵巢癌更具侵襲性和轉(zhuǎn)移性。VM結(jié)構(gòu)中癌細(xì)胞之間以及癌細(xì)胞與基質(zhì)間黏附作用的存在是通過(guò)細(xì)胞黏附分子(cellular adhesion molecules,CAMs)發(fā)揮關(guān)鍵性的作用,其中E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)是黏附分子中的重要成員,其表達(dá)程度的變化直接關(guān)系到腫瘤的生物學(xué)行為。本研究通過(guò)對(duì)80例上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)根治性手術(shù)病例標(biāo)本VM及E-cad水平的檢測(cè),探討其表達(dá)與卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的關(guān)系。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 一般資料 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2000年1月~2002年12月存檔石蠟包埋EOC組織標(biāo)本80例(術(shù)前未行放、化療)和卵巢良性上皮性腫瘤組織標(biāo)本20例,所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料,入選病例隨訪至患者死亡或截止2010年11月,隨訪時(shí)間為7~96個(gè)月。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer,UICC)2002版腫瘤PTNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期,早期(FIGOⅠ、Ⅱ期)卵巢癌40例,晚期(FIGOⅢ、Ⅳ期)卵巢癌40例;漿液性癌70例,黏液性癌10例;有腹腔臟器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例,有腹水者21例。年齡19~76歲,中位年齡50.2歲,≥50歲33例,<50歲47例;腫瘤平均最大長(zhǎng)徑(diameter,D)為5.3 cm,D≥5.0 cm 48例,D<5.0 cm 32例。選擇20例良性上皮性卵巢腫瘤患者手術(shù)切除標(biāo)本作為良性對(duì)照組。復(fù)閱上述患者的病理切片,選取存檔的患者手術(shù)標(biāo)本石蠟塊進(jìn)行切片,厚度4 μm。

    1.2 試劑 鼠抗人 CD34單克隆抗體(克隆號(hào)QBEnd/10)以及鼠抗人E-cad單克隆抗體[克隆號(hào):MM(36B5)],ElivisionTMPlus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。過(guò)碘酸Schiff(periodic acid-Schiff,PAS)染色液為蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科配制。

    2 方法

    2.1 免疫組織化學(xué)ElivisionTMPlus法 將石蠟標(biāo)本以4 μm厚連續(xù)切片,烤干,于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用已知陽(yáng)性片作對(duì)照,以PBS液代替Ⅰ抗作空白對(duì)照。

    2.2 CD34和PAS套染 CD34免疫組化染色,DAB顯色后,水流沖洗1 min終止顯色反應(yīng),將切片置于0.5%高碘酸溶液中氧化5~8 min。流水沖洗2 min,再用蒸餾水洗1次,于暗處置于Schiff液中染色10~20 min,然后用0.5%偏重亞硫酸鈉液滴洗2次,每次1 min,流水沖洗2 min;此后依次蘇木素淺染細(xì)胞核、鹽酸乙醇分化、返藍(lán)、脫水透明以及中性樹膠封片。

    2.3 微血管密度(microvessel density,MVD)計(jì)數(shù)CD34主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞漿和胞膜,從而可以通過(guò)CD34的陽(yáng)性表達(dá)來(lái)進(jìn)行MVD計(jì)數(shù),參照文獻(xiàn)[1]來(lái)計(jì)數(shù)。

    2.4 結(jié)果判定 CD34和E-cad均以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。采取二次計(jì)分法:每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400),計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比并計(jì)分。首先將染色強(qiáng)度計(jì)分:0分為無(wú)色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。再將陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分,0分為陰性,1分為陽(yáng)性細(xì)胞<10%,2分為11% -50%,3分為51%-75%,4分為>75%。用染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達(dá)結(jié)果,若積分≤2為陰性,>2為陽(yáng)性。免疫組化結(jié)果由高年資病理醫(yī)師讀片評(píng)定。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。VM和E-cad表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組生存分析用Kaplan-Meier法,組間比較用log-rank檢驗(yàn),多因素分析采用Cox回歸多因素模型,VM和E-cad在EOC組織中表達(dá)與卵巢良性上皮性腫瘤組織、各臨床及病理因素的相關(guān)性采用Fisher精確概率法檢驗(yàn)。

    結(jié) 果

    1 卵巢EOC及良性上皮性腫瘤組織中VM及E-cad蛋白的表達(dá)

    EOC組織中可檢測(cè)到VM的存在,在蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色切片中查見(jiàn)由腫瘤細(xì)胞圍繞形成的管腔樣結(jié)構(gòu),腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞,見(jiàn)圖1A;通過(guò) CD34和 PAS套染,VM表現(xiàn)為PAS陽(yáng)性染色但CD34陰性的管腔樣結(jié)構(gòu),具有VM的腫瘤細(xì)胞附近不見(jiàn)壞死的腫瘤細(xì)胞,血管則表現(xiàn)為CD34及PAS染色均為陽(yáng)性的管腔樣結(jié)構(gòu);而CD34及PAS染色均為陰性的管腔樣結(jié)構(gòu)則并非VM,見(jiàn)圖1B、C、D。E-cad主要表達(dá)于卵巢癌細(xì)胞漿,呈棕黃色,見(jiàn)圖1E,但是有VM存在的EOC組織中E-cad多為陰性表達(dá),見(jiàn)圖1F。EOC組及良性上皮性腫瘤組中VM檢測(cè)陽(yáng)性率分別為57.4%(46/80)及0%(0/20),E-cad蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為48.7%(39/80)及75.0%(15/20),2組差異均顯著(P <0.05),見(jiàn)表1。

    Figure 1.VM and E-cad expression in EOC(×400).A:HE staining(black arrows indicated VM);B~D:CD34 and PAS double staining(black arrows in B and C indicated VM,with PAS-positive and CD34-negative staining;red arrows in B,C and D indicated capillary,with positive staining of CD34 and PAS;the yellow arrow in D indicated the structure with negative staining of CD34 and PAS);E~F:immunohistochemical staining of E-cad was positive in E and negative in F.圖1 EOC中的VM和E-cad表達(dá)

    表1 EOC及卵巢良性上皮性腫瘤組織中VM和E-cad蛋白表達(dá)Table 1.VM and E -cad expression in EOC and benign epithelial tumor tissues[n(%)]

    2 EOC中VM及E-cad表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

    VM及E-cad表達(dá)陽(yáng)性率與患者的年齡、腫瘤的大小、組織學(xué)類型以及患者有無(wú)腹水之間差異均無(wú)顯著(P>0.05)。EOC的分化越低,VM越多,差異顯著(P<0.05);PTNM分期Ⅰ-Ⅱ期VM陽(yáng)性率為27.9%(12/43),Ⅲ-Ⅳ期VM陽(yáng)性率為91.9%(34/37),VM組的PTNM分期與無(wú)VM組的PTNM分期相比差異顯著(P<0.05);VM組的患者更易發(fā)生腹腔臟器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05),見(jiàn)表2。EOC的分化越高,E-cad表達(dá)越強(qiáng);伴有腹腔臟器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中E-cad表達(dá)降低,差異均顯著(P<0.05)。Ⅰ-Ⅱ期腫瘤中E-cad的陽(yáng)性率為72.1%(31/43),Ⅲ-Ⅳ期腫瘤中E-cad的陽(yáng)性率為21.6%(8/37),兩者之間差異顯著(P<0.05),見(jiàn)表2。

    3 EOC中VM與E-cad表達(dá)的關(guān)系

    Spearman相關(guān)分析顯示,在EOC中VM與E-cad的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r= -0.578,P<0.01),見(jiàn)表3。

    4 多因素分析

    將病理組織分化(分為高分化組、中分化組與低分化組)、年齡(分為≥50歲組與<50歲組)、PTNM分期(分為Ⅰ-Ⅱ期組與Ⅲ-Ⅳ期組)、腫瘤直徑(分為≥5.0 cm組與<5.0 cm組)、腹腔臟器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(分為有轉(zhuǎn)移組與無(wú)轉(zhuǎn)移組)、腹水(分為有腹水組與無(wú)腹水組)、VM(分為表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組)、MVD(因?yàn)镸VD的均值為22.99±12.40,故以MVD<22為陰性;MVD≥22為陽(yáng)性)和E-cad(分為表達(dá)陽(yáng)性組與陰性組)等因素引入Cox模型進(jìn)行多因素分析,結(jié)果顯示:VM、E-cad表達(dá)、PTNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響EOC根治術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立因素,見(jiàn)表4。

    表2 80例EOC組織中VM和E-cad的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Table 2.Correlation of VM and E-cad expression to clinicopathologic indexes of 80 cases of EOC[n(%)]

    表3 EOC中VM與E-cad表達(dá)之間的關(guān)系Table 3.Correlation of VM to E-cad expression in EOC

    5 生存率分析

    本組病例總的5年生存率為40.0%。Kaplan-Meier生存分析顯示VM陽(yáng)性組與陰性組5年生存率分別為4.3%和88.2%,差異顯著(P<0.01);E-cad陽(yáng)性組與陰性組5年生存率分別為71.8%和9.8%,差異顯著(P<0.01),生存曲線見(jiàn)圖2。

    表4 80例EOC患者多因素分析Table 4.Multivariate survival analysis of 80 patients with EOC

    討 論

    Figure 2.Survival curves of EOC patients with positive or negative VM(A)and E-cad expression(B).圖2 VM和E-cad表達(dá)陽(yáng)性或陰性對(duì)EOC患者生存率的影響

    卵巢癌由于發(fā)病隱匿,早期難以察覺(jué),就診時(shí)多處臨床晚期,腫瘤都多已發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)移,手術(shù)難以根治,且術(shù)后常有復(fù)發(fā)。因此,卵巢癌被認(rèn)為是預(yù)后最差的婦科惡性腫瘤之一。卵巢癌的腫瘤血管生成具有多樣性[2],存在血管生成(angiogenesis)、血管形成(vasculogenesis)和VM 3種方式。這些血管新生方式與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等惡性生物行為密切相關(guān)。VM是1999年Maniotis等[3]在研究高侵襲性葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種獨(dú)特的腫瘤血液供應(yīng)方式,F(xiàn)olberg等[4]對(duì)VM定義為:由侵襲性腫瘤細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞連接、以細(xì)胞外基質(zhì)成分為分隔而形成的微循環(huán)管道。隨后,VM相繼在卵巢癌、肝癌、前列腺癌以及橫紋肌肉瘤[5-7]等高度惡性的腫瘤中被發(fā)現(xiàn),且研究表明,VM的存在與侵襲性腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)[8]。VM管道直接由腫瘤細(xì)胞圍成,腫瘤細(xì)胞與血流之間僅有一層PAS陽(yáng)性的基底膜樣物相隔,無(wú)血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障,因此腫瘤細(xì)胞釋放的蛋白水解酶能夠更容易地溶解基底膜樣物而使腫瘤細(xì)胞直接進(jìn)入血液,從而有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。也有學(xué)者對(duì)VM的存在持否定態(tài)度,他們認(rèn)為VM是腫瘤組織內(nèi)出血和壞死所致的假象,Shirakawa等[9]以充分的證據(jù)表明VM 是腫瘤組織內(nèi)的一個(gè)功能性微循環(huán),而并非出血壞死的腫瘤組織形成的腔隙,血管造影顯示VM內(nèi)有血流通過(guò),從而證實(shí)VM為血管樣結(jié)構(gòu),同時(shí)其研究發(fā)現(xiàn),7.9%的人乳腺癌組織中存在VM現(xiàn)象,具有VM的患者更易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移而且生存期較短。Hoffmeyer等[10]認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞高表達(dá)E-cad和ras相似基因家族成員 A(ras homolog gene family,member A,RhoA),且對(duì)于I型膠原有更強(qiáng)的親合力,可能是炎性乳腺癌發(fā)生VM的機(jī)制之一。Sood等[11]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌也存在VM現(xiàn)象,在含有基質(zhì)膠(Matrigel)或I型膠原的三維培養(yǎng)體系中,高侵襲性卵巢癌細(xì)胞(SKOV3和EG)能形成VM管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其中缺乏內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞,而低侵襲性卵巢癌細(xì)胞沒(méi)有VM現(xiàn)象。趙秀蘭等[6]通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞肝癌中VM的研究發(fā)現(xiàn),不同分化程度的肝癌中均可有VM的存在,但低分化者VM陽(yáng)性率高于高分化者。Folberg等[12]認(rèn)為,VM結(jié)構(gòu)由于缺乏內(nèi)皮細(xì)胞襯覆,管壁上的腫瘤細(xì)胞容易脫落進(jìn)入管道中,進(jìn)入血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,因此與腫瘤的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。

    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)80例卵巢EOC組織的檢測(cè),在46例病例中發(fā)現(xiàn)了符合VM標(biāo)準(zhǔn)的管道結(jié)構(gòu),證實(shí)了在EOC中確實(shí)有VM的存在。VM存在的區(qū)域很少出現(xiàn)壞死,且VM的檢出率與腫瘤細(xì)胞分化程度、腫瘤轉(zhuǎn)移與否及臨床分期等密切相關(guān)。即伴有VM存在的EOC具有低分化、臨床分期晚以及更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),這與上述國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

    鈣黏蛋白是一組 Ca2+依賴性跨膜糖蛋白,E-cad是家族中的主要成員,其基因定位于16q22.1。E-cad普遍存在于各類上皮組織中,是上皮細(xì)胞的標(biāo)志物,主要分布于同種上皮細(xì)胞側(cè)面的黏附小帶處,在極化上皮細(xì)胞之間的黏附起主要作用[13]。E-cad介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附連接,在胚胎發(fā)育、形態(tài)學(xué)發(fā)生、細(xì)胞分化、上皮極性與完整性的維持方面起著重要作用,是重要的細(xì)胞 -細(xì)胞間粘附分子。E-cad異常表達(dá)是分子離散的基礎(chǔ),其表達(dá)的減少及確實(shí)與人類各種腫瘤侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系較為密切。Fujioka等[14]的研究表明,卵巢上皮性癌E-cad表達(dá)較正常卵巢表面上皮下降,高分化卵巢上皮性癌E-cad表達(dá)高于中、低分化癌(P<0.05),與原發(fā)灶相比,60%周圍轉(zhuǎn)移病變出現(xiàn)E-cad表達(dá)下降。Faleiro-Rodrigues等[15]指出卵巢腫瘤惡性程度越高,E-cad陽(yáng)性表達(dá)率越低,E-cad表達(dá)與卵巢癌的FIGO分期(P<0.05)、組織亞型(P<0.01)、腹膜轉(zhuǎn)移(P<0.01)和殘余病灶大小(P<0.01)有關(guān)。

    本研究結(jié)果顯示E-cad的表達(dá)與EOC的分化程度、轉(zhuǎn)移情況及臨床分期等因素呈現(xiàn)相關(guān)性,即隨著E-cad表達(dá)的降低,EOC出現(xiàn)分化降低、臨床分期晚以及更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。并且本研究發(fā)現(xiàn),在EOC中,隨著E-cad表達(dá)率的降低,VM的陽(yáng)性率顯著升高,兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性(r=-0.578,P<0.01)。這一結(jié)果提示在EOC的VM形成過(guò)程中,E-cad可能起到某種關(guān)鍵性作用。我們推測(cè),隨著E-cad表達(dá)的減少,不僅使細(xì)胞間附著變得松散,也使得細(xì)胞內(nèi)骨架缺少相鄰細(xì)胞因黏附而形成的固定作用,從而獲得自身變形并形成細(xì)胞間腔隙的能力,從而促進(jìn)VM的形成。

    本研究多因素分析顯示,VM、E-cad表達(dá)、PTNM分期和腹腔臟器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響EOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。進(jìn)一步的生存分析提示VM陽(yáng)性組比VM陰性組有更低的5年生存率,這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相同;此外,E-cad陽(yáng)性組的5年生存率顯著高于陰性組,提示E-cad的表達(dá)對(duì)于EOC患者的生存率及生存期預(yù)后的估計(jì)可能有一定的指導(dǎo)意義。

    [1]Kumda T,Tsuneyama K,Hatta H,et al.Improved 1 -h(huán) rapid immunostaining method using intermitten microwave irradiation:practicability based on 5 years application in Toyama Medical and Pharmaceutical University Hospital[J].Mod Pathol,2004,17(9):1141 -1149.

    [2]堯良清,顧漪萍,豐有吉,等.卵巢癌血管生成的多樣性[J].中國(guó)病理生理雜志,2008,24(1):195-197.

    [3]Maniotis AJ,F(xiàn)olberg R,Hess A,et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry[J].Am J Pathol,1999,155(3):739-752.

    [4]Folberg R,Maniotis AJ.Vasculogenic mimicry[J].APMIS,2004,112(7-8):508-525.

    [5]Sood AK,Seftor EA,F(xiàn)letcher MS,et al.Molecular determinants of ovarian cancer plasticity [J].Am J Pathol,2001,158(4):1279-1288.

    [6]趙秀蘭,杜 靜,張?jiān)娢?,?肝細(xì)胞肝癌中血管生成擬態(tài)的研究[J].中華肝臟病雜志,2006,14(1):41-44.

    [7]Danny R,Gray I,Wendy J,et al.Short- term human prostate primary xenografts:an in vivo model of human prostate cancer vasculature and angiogenesis[J].Cancer Res,2004,64(3):1712 -1721.

    [8]Yue WY,Chen ZP.Does vasculogenic mimicry in astrocytoma?[J].J Histochem Cytochem,2005,53(8):997-1002.

    [9]Shirakawa K,Kobayashi H,Sobajima J,et al.Inflammatory breast cancer:vasculogenic mimicry and its hemodynamics of an inflammatory breast cancer xenograft model[J].Breast Cancer Res,2003,5(3):136 -139.

    [10]Hoffmeyer MR,Wall KM,Dharmawardhane SF.In vitro analysis of the invasive phenotype of SUM 149,an inflammatory breast cancer cell line[J].Cancer Cell Int,2005,5(1):11.

    [11]Sood AK,F(xiàn)letcher MS,Coffin JE,et al.Functional role of matrix metalloproteinases in ovarian tumor cell plasticity[J].Am J Obstet Gynecol,2004,190(4):899 -909

    [12]Folberg R,Maniotis AJ.Vasculogenic mimicry[J].APMIS,2004,112(7-8):508-525.

    [13]Yagi T,Takeichi M.Cadherin superfamily genes:functions,genomic organization,and neurologic diversity[J].Genes Dev,2000,14(10):1169-1180.

    [14]Fujioka T,Takebayashi Y,Kihana T,et al.Expression of E -cadherin and β - catenin in primary and peritoneal metastatic ovarian carcinoma[J].Oncol Rep,2001,8(2):249-255.

    [15]Faleiro-Rodrigues C,Macedo-Pinto I,Pereira D,et al.Association of E - cadherin and β - catenin immunoexpression with clinicopathologic features in primary ovarian carcinomas[J].Hum Pathol,2004,35(6):663 -669.

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