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    Prohibitin在低膽固醇培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞系PC-3中表達(dá)上調(diào)及其可能機(jī)制*

    2011-08-02 07:38:58李永紅劉卓煒周芳堅
    中國病理生理雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:螢光雄激素前列腺癌

    董 培, 李永紅, 堯 凱, 劉卓煒, 周芳堅

    (華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室,中山大學(xué)腫瘤防治中心泌尿外科,廣東 廣州 510060)

    高脂肪/膽固醇等“西方飲食”同前列腺癌的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)[1]。高血清膽固醇水平能夠促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展。然而,循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明,采用膽固醇合成抑制藥物如羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxymethylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶抑制劑并不能降低前列腺癌整體風(fēng)險率[2],具體機(jī)制尚未明確。我們研究發(fā)現(xiàn),低膽固醇培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞中prohibitin(PHB)表達(dá)升高。本實驗通過構(gòu)建PHB基因啟動子調(diào)控的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞,分析其轉(zhuǎn)染活性并進(jìn)一步驗證其膽固醇敏感活性,為進(jìn)一步研究其在膽固醇影響前列腺癌進(jìn)展的基因研究提供基礎(chǔ)。

    材料和方法

    1 材料

    螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic為Pro-mega產(chǎn)品,前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞為中山大學(xué)腫瘤防治中心實驗室保存。DNA聚合酶、Xho I、Hind III和T4 DNA連接酶為New England Biolabs產(chǎn)品;脂質(zhì)Lipofectamine 2000為Invitrogen產(chǎn)品;質(zhì)粒純化試劑盒及膠回收試劑盒為Qiagen產(chǎn)品,Luciferase Assay System為Promega產(chǎn)品。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 實驗分為對照組和實驗組,對照組PC-3細(xì)胞株傳代培養(yǎng)于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,加入10 mL DMEM+10%FBS培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。實驗組棄去培養(yǎng)液,加入12 mL DMEM+10%脂蛋白缺乏血清(lipoproteindeficient fetal bovine serum,LPDS)+50 μmol/L甲羥戊酸鹽(mevalonate)和50 μmol/L司伐他汀(simvastatin)培養(yǎng)液。繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

    2.2 Real-time PCR定量檢測 PHB mRNA 培養(yǎng)48 h后,Trizol一步法提取總RNA后,按說明書操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中人PHB基因序列號(NM_002634)的mRNA序列,根據(jù)引物設(shè)計原則,運(yùn)用Oligo 6引物設(shè)計軟件設(shè)計。選定核苷酸號為131-305的序列,上游引物5'-GGAGGCGTGGTGAACTCTG -3',下游引物 5'- CTGGCACATTACGTGGTCG A G-3',擴(kuò)增片段長度為175 bp。以GAPDH為內(nèi)參照引物,上游引物 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG -3',下游引物 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3',擴(kuò)增片段長度為317 bp。反應(yīng)體系加入SYBR? Green PCR Master Mix,按照試劑盒要求配置?;旌蠘悠肪鶆蚣尤胫罙BI MicroAmp光學(xué)96孔反應(yīng)板中,蓋上蓋子密封,離心、去除氣泡。每份樣本重復(fù)3次以減小加樣誤差。在ABI PRISM 7900HT擴(kuò)增儀上設(shè)置95℃預(yù)變性5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)35次,4 ℃終止反應(yīng)?;虮磉_(dá)結(jié)果分析運(yùn)用2-ΔΔCt法分析。

    2.3 PHB基因啟動子引物的設(shè)計和合成 根據(jù)GenBank中人 PHB promoter(GenBank accession#DQ406856)的mRNA序列,運(yùn)用人17染色體基因DNA為模板參照文獻(xiàn)設(shè)計:正向引物 5'-GCAACTCGAGGGAGAAACCCCGTCTCTAC-3'(下劃線核苷酸部分為Xho I內(nèi)切酶位點),前面采取4個堿基進(jìn)行硫代修飾,反向引物 5'-GCAAAAGCTTCCTCACAAGTCGGACTCACGC -3'(下劃線核苷酸部分為Hind III內(nèi)切酶位點),前面采取4個堿基進(jìn)行硫代修飾。同時選擇低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor,LDLR)為陽性對照,根據(jù)GenBank中LDLR promoter(GenBank accession#L29401)的堿基序列,以人總?cè)旧wDNA為模板參照文獻(xiàn)設(shè)計:正向引物5'-CTCGAGCTTCACGGGTTAAAAGCCGATGTCACA-3'(下劃線核苷酸部分為 Xho I內(nèi)切酶 位點)。反向引物5'-AAGCTTATTGCACTCGGGGCCCACGTCATTTA-3'(下劃線核苷酸部分為Hind III內(nèi)切酶位點)。經(jīng)過BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析,確認(rèn)靶向基因的特異性后進(jìn)行實驗。引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。

    2.4 PCR擴(kuò)增及鑒定 采用Platinum Pfx DNA polymerase(Invitrogen)PCR反應(yīng)體系,按照試劑盒要求配置。要求配置94℃預(yù)變性2 min,94℃ 15 s,55℃ 30 s,68 ℃ 1 min/kb,循環(huán) 35次,72 ℃10 min,4℃終止反應(yīng)。合成產(chǎn)物用基因序列測序證實,并用紫外分光光度計測定產(chǎn)物的濃度及純度并紀(jì)錄。

    2.5 pGL3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用Xho I和Hind III內(nèi)切酶雙酶切 PCR產(chǎn)物,得到PHB-Pro、LDLR-Pro和pGL3-Basic載體,凝膠電泳后從凝膠中提取純化DNA,回收的片段用T4 DNA連接酶16℃連接過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在Amp抗性平板上篩選重組質(zhì)粒。用SacⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定并送公司DNA測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPHB-1192、pLDLR-234。

    2.6 重組質(zhì)粒的活性分析 分別將pPHB-1192、pLDLR-234及陰性對照質(zhì)粒pGL3-Basic轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系PC-3,以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染對照組(NM),同步進(jìn)行實驗。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后,更換細(xì)胞培養(yǎng)液為普通培養(yǎng)基對照組、低膽固醇培養(yǎng)基+膽固醇組(低膽固醇培養(yǎng)基+10 mg/L膽固醇+1 mg/L 25-羥基膽固醇(LPDS+CHO)和低膽固醇培養(yǎng)基組(LPDS)。繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。裂解細(xì)胞,加入螢光素酶檢測試劑,Luminometer Model(Promega)上每孔自動加入100 μL Luciferase Assay Reagent檢測螢光值。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 低膽固醇對PC-3細(xì)胞PHB mRNA表達(dá)的影響

    在低膽固醇培養(yǎng)條件下,PC-3細(xì)胞內(nèi)的PHB表達(dá)明顯上調(diào),與對照組相比較有顯著差異(P<0.01),見圖 1。

    Figure 1.Expression of PHB mRNA increased after CDM treatment.**P < 0.01 vs NM control group.圖1 CDM誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞PHB mRNA表達(dá)

    2 重組質(zhì)粒pPHB-1192和pLDLR-234的鑒定

    經(jīng)Xho I和Hind III雙酶切后分別可見到大小約全長為1192 bp和234 bp的PHB-Pro和LDLRPro基因片段,約6000 bp處可見pGL3-Basic片段,結(jié)果與設(shè)計相符,測序結(jié)果與目的基因組一致,見圖2。

    Figure 2.Gel electrophoresis result after plasmid was digested by Xho I and Hind III.M:DNA marker.圖2 雙酶切后電泳結(jié)果

    3 重組質(zhì)粒螢光素酶活性分析

    螢光檢測結(jié)果顯示,同空白對照組pGL3比較,實驗組pPHB-1192 luciferase表達(dá)顯著增強(qiáng),兩組比較有顯著差異(P<0.05),表明轉(zhuǎn)染效率高。同普通培養(yǎng)基組相比較,低膽固醇培養(yǎng)基組luciferase表達(dá)顯著升高,兩組比較有顯著差異(P<0.05)。在低膽固醇培養(yǎng)基組中加入膽固醇,其luciferase表達(dá)顯著降低,兩組比較有顯著差異(P<0.05),表明低膽固醇誘導(dǎo)PHB在PC-3細(xì)胞中表達(dá),見表1。

    表1 重組質(zhì)粒在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞中螢光素酶表達(dá)的比較Table 1.Comparison of luciferase expression of recombinant plasmids in PC-3 cells cultured in different media(.n=3)

    表1 重組質(zhì)粒在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞中螢光素酶表達(dá)的比較Table 1.Comparison of luciferase expression of recombinant plasmids in PC-3 cells cultured in different media(.n=3)

    *P <0.05 vs LPDS in the same group.

    Group LPDS LPDS+CHO NM pGL3 1 1 1 pLDLR -234 9.182 ±0.596 3.208 ±0.276* 4.001 ±0.369*pPHB -1192 70.057 ±2.109 33.615 ±4.063* 39.253 ±2.183*

    討 論

    研究發(fā)現(xiàn),肥胖和多種疾病進(jìn)展有關(guān),進(jìn)展期的前列腺癌膽固醇升高,高脂肪/膽固醇等“西方飲食”同前列腺癌的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)[3]。尚未清楚為什么高膽固醇可改變信號分子和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增生,目前研究表明是腫瘤細(xì)胞膜上的膽固醇變化導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein,SREBP)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),使前列腺癌表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性。細(xì)胞保持膽固醇的動態(tài)平衡的能力在很大程度上受到SREBP轉(zhuǎn)錄因子控制。這些SREBP由3個相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子組成:SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2。SREBP-1a和 SREBP-1c定位于染色體17q11.2,由SREBP-1基因的不同啟動子編碼產(chǎn)生。SREBP-1a主要調(diào)控膽固醇和脂肪酸合酶,如HMG-CoA以及甘油三酯代謝的LDLR的基因轉(zhuǎn)錄;SREBP-1c選擇調(diào)控脂肪酸、甘油三酯。SREBP-2定位于22q13,主要調(diào)控膽固醇合成的甲羥戊酸基因如法呢基焦磷酸合酶和HMG-CoA還原酶[4]。

    Heemers等[5]使用2個獨立的前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP和MDA–Pca-2a)并且給予雄激素刺激,證實了在雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞系中普遍存在受雄激素協(xié)調(diào)刺激的LDLR和HMG-CoA表達(dá),并且包括了SREBP途徑活化作用。Ettinger等[6]通過對前列腺癌LNCaP異種移植的裸鼠腫瘤模型研究發(fā)現(xiàn),去勢后SREBP-1a、-1c和-2呈中等程度升高。在雄激素抵抗期(第21-28 d),SREBP-1a和1c表達(dá)較去勢前顯著升高。雄激素刺激導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavageactivating protein,SCAP)增加。SCAP水平升高增加成熟SREBP產(chǎn)生和刺激脂肪生成基因表達(dá)。SCAP在去勢治療后降低而在雄激素抵抗期顯著升高。Montgomery等[7]分別對于人體原位及轉(zhuǎn)移前列腺癌及裸鼠移植的前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行研究證實,雄激素抵抗的前列腺癌組織內(nèi)的類固醇生成酶如FASN、CYP17A1、HSD3B1、HSD17B3、CYP19A1 和 UGT2B17均高于原位前列腺癌。

    PHB基因是一種有效的腫瘤抑制基因,因其具有明顯的抗細(xì)胞增殖、抗腫瘤作用而得名。PHB能抑制細(xì)胞增殖,這種作用是細(xì)胞周期特異性的,主要在G期-S期之間發(fā)揮檢查點的作用,抑制核轉(zhuǎn)錄因子E2F的轉(zhuǎn)錄活性,調(diào)控Ras-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,對于細(xì)胞生存至關(guān)重要[8]。PHB作為雄激素信號的目標(biāo)蛋白,能夠抑制雄激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞增殖。Gamble等[9]研究發(fā)現(xiàn)在雄激素刺激增殖的前列腺癌LNCaP細(xì)胞中PHB表達(dá)下調(diào)超過50%,過度表達(dá)PHB抑制雄激素刺激的LNCaP細(xì)胞增殖,而抑制其表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞增殖,提示PHB具有調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖作用。此后研究證實,PHB作為雄激素受體(androgen receptor,AR)的核共遏制物,可能在前列腺癌進(jìn)展為雄激素非依賴過程中發(fā)揮作用[10]。

    研究發(fā)現(xiàn),低氧條件下小鼠肝細(xì)胞膜和線粒體PHB水平依次增加,提示其在細(xì)胞感受外界環(huán)境氧變化、相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及低氧時細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮保護(hù)作用[11]。另外,PHB能夠抑制E2F介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄,從而保護(hù)人RAMOS B淋巴細(xì)胞免受DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑喜樹堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[12]。在雌激素拮抗劑治療的乳腺癌細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn),PHB和共阻遏物 Brg1/Brm的高表達(dá),PHB與E2F1和p53共定位到細(xì)胞核并能增強(qiáng)E2F1和p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活動[13],從而發(fā)揮抗凋亡作用。這些研究表明,PHB通過抑制E2F介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用,從而使腫瘤細(xì)胞逃避雌激素拮抗劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致激素非依賴性進(jìn)展。

    本研究以前列腺PC-3細(xì)胞為細(xì)胞模型,采用real-time PCR證實,在普通培養(yǎng)基中PC-3細(xì)胞中PHB mRNA低水平正常表達(dá),在膽固醇缺乏條件作用48 h后,PHB表達(dá)顯著上調(diào)??寺HB啟動子基因片段并構(gòu)建轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,并以LDLR啟動子質(zhì)粒作為陽性對照,結(jié)果表明,PHB啟動子質(zhì)粒在前列腺癌PC-3細(xì)胞中顯示出良好的轉(zhuǎn)錄活性,且在低膽固醇培養(yǎng)細(xì)胞中顯著表達(dá)上調(diào)。PHB上調(diào)抑制腫瘤細(xì)胞增殖,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避抗腫瘤藥物和不良因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,這可能是前列腺癌內(nèi)分泌治療有限、雄激素抵抗進(jìn)展的重要原因之一。

    由于本實驗僅在體外檢測了前列腺癌雄激素非依賴PC-3細(xì)胞中PHB表達(dá)情況,下一步實驗需要對多種前列腺癌細(xì)胞株進(jìn)行檢測,并進(jìn)一步分析PHB中膽固醇敏感作用位點,同時需模擬體內(nèi)環(huán)境,構(gòu)建實驗動物模型,為理解前列腺癌發(fā)生、發(fā)展和臨床前列腺癌治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。

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