PAR-2在人胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及吉西他濱的干預(yù)作用

劉 星 胡煜輝 肖游章 張曉春 周 青 徐建華 肖 鳳 羅友根 李曉飛

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 吉安 343000)

最新研究表明，蛋白酶激活受體-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)與惡性腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔1〕。其他文獻(xiàn)也認(rèn)為PAR-2能被其內(nèi)源激活劑胰蛋白酶激活，從而影響組織功能〔2〕。綜合以上各種研究結(jié)果，筆者推測PAR-2在人胰腺癌細(xì)胞中具有很高的表達(dá)，而基于PAR-2相關(guān)的胰腺癌的治療方案也必將成為新的研究熱點(diǎn)。目前，吉西他濱是治療胰腺癌的首選藥物〔3〕。本研究擬從腫瘤病理學(xué)及分子生物學(xué)的最新理論出發(fā)，旨在研究PAR-2在人胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)態(tài)勢，并通過RT-PCR觀察吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞中PAR-2表達(dá)的影響，初步探討吉西他濱治療胰腺癌的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為胰腺癌基因靶向治療的進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購于中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 儀器與試劑 TRIzol Reagent(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄和qPCR所用試劑分別為RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit(Fermentas公司)，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(Invitrogen公司);DEPC水(Invitrogen公司);高糖DMEM(GIBCO公司);胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)。定量PCR儀:BIO-RAD MJ Mini Opticon Real-Time PCR System，配套使用的軟件為BIO-RAD CFX Manager;雙人雙面垂直凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司);高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司);PAR-2引物由上海華大基因合成。注射用鹽酸吉西他濱(商品名:澤菲，江蘇豪森藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H20030105)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1培養(yǎng)選用含有10%新生牛血清的DMEM，置37℃、95%濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿25 cm2培養(yǎng)瓶底部70% ～80%時(shí)，消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，按105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，并分為:cancer組(胰腺癌細(xì)胞陽性對照組)、Gao組(高劑量干預(yù)，吉西他濱給藥濃度50 μg/ml)、Zhong組(中劑量干預(yù)，吉西他濱給藥濃度5 μg/ml)、Di組(低劑量干預(yù)，吉西他濱給藥濃度0.5 μg/ml)，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔。貼壁過夜后，用無血清DMEM同步化24 h，再給藥24 h，按試劑盒要求提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ「鹘M細(xì)胞分別進(jìn)行基因擴(kuò)增，以內(nèi)參對照。正常胰腺組織取自南昌市第二醫(yī)院，設(shè)為normal組(正常胰腺組織陰性對照組):液氮研磨后，提取總RNA，按試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行基因擴(kuò)增。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 采用RNA分離試劑盒TRIzol提取并純化細(xì)胞總RNA;所有RNA樣本濃度均稀釋至1 g/L，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，均按說明書進(jìn)行。(1)RT-PCR引物序列見表1，GAPDH基因的 PCR產(chǎn)物大小為88 bp，PAR-2基因的PCR產(chǎn)物大小為222 bp。(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:Mix 12.5 μl;SYBR Green I 5.0 μl;正向引物 1 μl;反向引物 1 μl;ddH2O 4.5 μl;cDNA 1 μl。(3)反應(yīng)條件 Protocol:1:95.0℃ 6.00 min;2:95.0℃ 30 s;3:60.0℃ 30 s;4:72.0℃50 s;Plate Read;5:GOTO 2，65 more times;6:Melt Curve 65℃to 95℃:Increment 0.5℃ for 0.15 min;Plate Read。

1.2.3 計(jì)算 PCR軟件2-△△Ct方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，重復(fù)3次。①對所有的測試樣和校準(zhǔn)樣本，用內(nèi)參基因的CT值歸一目的基因的 CT值:△CT(test) = CT(target，test) － CT(ref，test);△CT(calibrator)=CT(target，calibrator) － CT(ref，calibrator)。② 用校準(zhǔn)樣本的△CT值歸一試驗(yàn)樣本的△CT值:△△CT=△CT(test)－△CT(calibrator)。③計(jì)算表達(dá)水平比率:2-△△Ct=表達(dá)量的比值。

得到的結(jié)果是通過參照基因表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)樣本中目標(biāo)基因相對于校準(zhǔn)樣本的增加或減少的倍數(shù)，用參照基因校準(zhǔn)目標(biāo)基因表達(dá)的目的是彌補(bǔ)樣本組織量的差異。

表1 RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以Quantity one分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS13.0軟件。組間比較采用方差分析(Dunnett-t檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

cancer組、Di組、Zhong組、Gao組中細(xì)胞 PAR-2 mRNA的相對表達(dá)量(15.94±0.25，5.70±2.03，5.36±0.17，6.85±2.00)均高于 normal組(1.00)，有顯著性差異(P＜0.001)。cancer組 ＞(Di組、Zhong組、Gao組)＞normal組;但是 Gao組、Zhong組、Di組三組間的相對表達(dá)量無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1。

圖1 各組PAR2 mRNA水平

3 討論

PARs家族含有7個(gè)跨膜單位，與G蛋白相耦聯(lián)，可通過介導(dǎo)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號轉(zhuǎn)道通路引起細(xì)胞核反應(yīng)，激活多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子〔4〕。PARs主要有四個(gè)亞型-PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4，其中PAR-1、PAR-3和PAR-4是凝血酶受體，而PAR-2是胰蛋白酶的細(xì)胞表面受體〔5，6〕。由于PARs獨(dú)特的激活與滅活方式以及在消化系統(tǒng)中的廣泛分布，使其在消化系統(tǒng)中有非常重要的作用〔7〕，而PAR-2與消化系腫瘤的關(guān)系更是備受關(guān)注〔8〕。人PAR-2基因位于5q13染色體，小鼠PAR-2基因位于13D2，均為雙外顯子，是胰島素、肥大細(xì)胞纖維蛋白溶酶、凝血因子Ⅶa、Ⅹa和其他未知蛋白水解酶的受體〔9〕。在蛋白水平，人PAR-2是開放閱讀框編碼397個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，與小鼠PAR-2的同源性為83%，與大鼠PAR-2的同源性為85%;在分子水平，PAR-2含有7個(gè)跨膜螺旋，氨基端位于細(xì)胞外，羧基端位于細(xì)胞內(nèi)，C-末端與受體脫敏和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，N-末端有相應(yīng)受體的蛋白酶裂解位點(diǎn)，易暴露于能使其激活的蛋白酶中，是許多消化系腺體外分泌的直接調(diào)控者〔10〕。

文獻(xiàn)報(bào)道PAR-2激動(dòng)劑不但可以促進(jìn)意識清醒的大鼠胰腺分泌〔11〕，也可促使離體大鼠胰腺及淀粉酶的分泌〔12〕;PAR-2在促進(jìn)小鼠胰腺分泌淀粉酶的同時(shí)，也促進(jìn)NO的產(chǎn)生〔13〕;在狗胰管的實(shí)驗(yàn)中，PAR-2激動(dòng)劑可迅速開放并迅速關(guān)閉離子通道〔14〕，而且可能與PAR-2在體內(nèi)誘導(dǎo)的胰液瞬間分泌升高有關(guān)，但是PAR-2在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其復(fù)雜機(jī)制目前仍不十分清楚。本研究中，筆者以Quantity one分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果cancer組、Di組、Zhong組、Gao組中細(xì)胞PAR-2 mRNA的相對表達(dá)量均高于normal組。提示胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展與PAR-2正相關(guān)。

吉西他濱是一種破壞細(xì)胞復(fù)制的二氟核苷類抗代謝物抗癌藥〔15〕，也是目前治療胰腺癌的最佳藥物。吉西他濱是去氧胞苷的水溶性類似物，對核糖核苷酸還原酶是一種抑制性的酶作用物的替代物，這種酶在DNA合成和修復(fù)過程中對所需要的脫氧核苷酸的生成是至關(guān)重要的〔14〕。本研究中，筆者將細(xì)胞分為cancer組(胰腺癌細(xì)胞陽性對照組)、Gao組(高劑量干預(yù)，吉西他濱給藥濃度50 μg/ml)、Zhong組(中劑量干預(yù)，吉西他濱給藥濃度5 μg/ml)、Di組(低劑量干預(yù)，吉西他濱給藥濃度0.5 μg/ml)及normal組(正常胰腺組織陰性對照組);并通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)觀察各組PAR-2 mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果cancer組＞Di組、Zhong組、Gao組＞normal組。提示相對于正常胰腺組織，PAR-2 mRNA在PANC-1胰腺癌細(xì)胞高表達(dá)，吉西他濱能夠降低PANC-1胰腺癌PAR-2 mRNA的表達(dá)率，可能是吉西他濱治療胰腺癌的作用機(jī)制之一。但是把3次PAR-2 mRNA基因表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，Gao組、Zhong組、Di組三組間的相對表達(dá)量差異無顯著性，即本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)吉西他濱對PAR-2 mRNA表達(dá)的干預(yù)作用與劑量有關(guān)，筆者認(rèn)為還需要更多的研究以進(jìn)一步探討。

1 海 鷗，謝立群，李 軒，等.蛋白酶激活受體-2在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)〔J〕.世界華人消化雜志，2010;18(20):2159-62.

2 Kawabata A，Kawao N.Physiology and pathophysiology of proteinase-activated receptors(PARs):PARs in the respiratory system:cellular signaling and physiological/pathological roles〔J〕.J Pharmacol Sci，2005;97(1):20-4.

3 王 偉.胰腺癌藥物治療新進(jìn)展〔J〕.臨床外科雜志，2009;17(01):45-7.

4 Inci K，Edebo A，Olbe L，et al.Expression of protease-activated-receptor 2(PAR-2)in human esophageal mucosa〔J〕.Scand J Gastroenterol，2009;44(6):664-71.

5 Zhang H，Yang H，He S.TNF increases expression of IL-4 and PARs in mast cells〔J〕.Cell Physiol Biochem，2010;26(3):327-36.

6 Arizmendi NG，Abel M，Mihara K，et al.Mucosal allergic sensitization tocockroach allergens is dependent on proteinase activity and proteinase-activated receptor-2 activation〔J〕.J Immunol，2011;186(5):3164-72.

7 Kawabata A，Kuroda R，Hollenberg MD.Physiology of protease-activated receptors(PARs):involvement of PARs in digestive functions〔J〕.Nippon Yakurigaku Zasshi，1999;114 Suppl 1:173P-179P.

8 Ikeda O，Egami H，Ishiko T，et al.Signal of proteinase-activated receptor-2 contributes to highly malignant potential of human pancreatic cancer by up-regulation of interleukin-8 release〔J〕.Int J Oncol，2006;28(4):939-46.

9 Kawabata A.PAR-2:structure，function and relevance to human diseases of the gastric mucosa〔J〕.Expert Rev Mol Med，2002;4(16):1-17.

10 Cottrell GS，Amadesi S，Schmidlin F，et al.Protease-activated receptor 2:activation，signalling and function〔J〕.Biochem Soc Trans，2003;31:1191-7.

11 Kawabata A，Nishikawa H，Kuroda R，et al.Proteinase-activated receptor-2(PAR-2):regulation of salivary and pancreatic exocrine secretion in vivo in rats and mice〔J〕.Br J Pharmacol，2000;129:1808-14.

12 Kawabata A，Kuroda R，Nishida M，et al.Protease-activated receptor-2(PAR-2)in the pancreas and parotid gland:immunolocalization and involvement of nitric oxide in the evoked amylase secretion〔J〕.Life Sci，2002;71:2435-46.

13 Nguyen TD，Moody MW，Steinhoff M，et al.Trypsin activates pancreatic duct epithelial cell ion channels through proteinase-activated receptor-2〔J〕.J Clin Invest，1999;103:261-9.

14 Kazuno H，Sakamoto K，F(xiàn)ujioka A，et al.Possible antitumor activity of 1-(3-C-ethynyl-beta-D-ribo-pentofuranosyl)cytosine(ECyd，TAS-106)against an established gemcitabine(dFdCyd)-resistant human pancreatic cancer cell line〔J〕.Cancer Sci，2005;96(5):295-302.

15 Aggarwal S，Yadav S，Gupta S.EGFR targeted PLGA nanoparticles using gemcitabine for treatment of pancreatic cancer〔J〕.J Biomed Nanotechnol，2011;7(1):137-8.