小窩蛋白-1反義寡核苷酸在AVP誘導(dǎo)大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及辛伐他汀的干預(yù)效應(yīng)

何燕萍 楊軍嶺 趙連友 劉少偉 (解放軍三二三醫(yī)院，陜西 西安 70054)

近年來(lái)，小窩和小窩蛋白的細(xì)胞生理作用日益受到人們的重視，尤其是在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇運(yùn)輸及腫瘤抑制等方面有著重要的意義〔1〕。目前一些研究也提示，小窩結(jié)構(gòu)的標(biāo)志蛋白是小窩蛋白，可能與高血壓的病理病生改變有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，小窩蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和纖連蛋白基質(zhì)的更新，從而參與高血壓的細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和組織修復(fù)病理病生過(guò)程〔2〕。并已證實(shí)，血管加壓素(AVP)在高血壓左室肥厚發(fā)生和發(fā)展中起重要作用〔3〕，心肌成纖維細(xì)胞(CFs)上有小窩蛋白-1大量表達(dá)〔4〕。AVP介導(dǎo)CFs增殖作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)如何在小窩上實(shí)現(xiàn)，目前尚不清楚。研究還發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)哪懝檀妓綄?duì)維持小窩結(jié)構(gòu)十分重要，膽固醇與小窩蛋白的結(jié)合能穩(wěn)定小窩蛋白寡聚體，從而協(xié)同小窩蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔5〕。他汀類藥是目前具有廣泛心血管保護(hù)作用的以降低膽固醇為主的降脂藥物，其抑制CFs增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是否與其降膽固醇作用并進(jìn)而與影響小窩結(jié)構(gòu)有關(guān)，目前還不十分明確。本研究設(shè)計(jì)合成小窩蛋白-1 AS ODN片段，旨在通過(guò)這種特異性抑制靶基因表達(dá)的細(xì)胞生物學(xué)研究手段，探討小窩蛋白-1在CFs增殖erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，以及辛伐他汀干預(yù)效應(yīng)與小窩蛋白-1介導(dǎo)erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系，為他汀類防治高血壓心臟間質(zhì)重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制提供新認(rèn)識(shí)，也為他汀類藥物防治心臟重構(gòu)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，體重200～250 g，6～8周齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。AVP、甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)、黃體酮(Pro)、膽固醇、erk1/2抗體、p-erk 1/2抗體、p21抗體、cyclinA抗體、cav 1抗體為Sigma公司產(chǎn)品，Western印跡熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Santa Cruz公司，辛伐他汀純品由湖北絲寶藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 心肌成纖維細(xì)胞(CFs)的培養(yǎng)和鑒定 腹腔麻醉(戊巴比妥50 mg/kg)6～8周齡SD大鼠后，無(wú)菌條件下迅速取出大鼠心臟，修剪去除心房和血管，僅留取心室部分。剪碎，PBS沖洗3次，加0.06%膠原酶Ⅱ和0.2%胰酶于37℃消化10～15 min，分 3次消化完畢。消化液經(jīng) 100目濾網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心共3次，每次用PBS清洗懸浮。所得細(xì)胞置于25 mm3培養(yǎng)瓶，100 ml/L胎牛血清的DMEM 100 ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、50 ml/L CO2及飽和濕度下培養(yǎng)100 min，采用差速貼壁法分離CFs，待細(xì)胞生長(zhǎng)近融合時(shí)，采用1∶3傳代。在倒置顯微鏡、透射電鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核明顯變大，呈橢圓形，常含有2～3個(gè)核。經(jīng)免疫組化纖維粘連蛋白染色陽(yáng)性和平滑肌肌動(dòng)蛋白染色陰性鑒定為所需的CFs，純度達(dá)0.98，錐蟲藍(lán)染色細(xì)胞活力大于0.97。實(shí)驗(yàn)采用3～4代細(xì)胞。

1.2.2 cav1反義寡核苷酸設(shè)計(jì)及處理 根據(jù)大鼠cav1的腳手架域cDNA序列設(shè)計(jì)反義、正義及錯(cuò)配寡核苷酸，序列運(yùn)用Blast程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索，無(wú)同源序列。由上海生工有限公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，寡核苷酸分子兩端堿基均行硫代修飾，反義寡核苷酸序列如下〔6〕:5'-AAA CTG TGT GTC CCT TCT GG-3'，所有堿基均以硫代磷酸基修飾，并以該序列的錯(cuò)義寡核苷酸為對(duì)照(錯(cuò)義序列5'-AAA CAG TCT GAC CGT TGT GG-3')。將cav1-AS ODN用無(wú)血清DMEM稀釋后加樣，終濃度為5×10－5mol/L。用脂質(zhì)體導(dǎo)入法將cav1-AS ODN導(dǎo)入CFs，孵育24 h后，檢測(cè)CFs的DNA合成，及p-erk1/2和cav1表達(dá)。

1.2.3 CFs的DNA合成功能測(cè)定 以3H-TdR摻入率反映CFs的DNA合成功能。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFs，0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×104/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μl，靜置培養(yǎng)至細(xì)胞接近融合。棄上清，加入無(wú)血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞維持生長(zhǎng)靜止?fàn)顟B(tài)。分別加入不同試劑干預(yù)。在最后的干預(yù)藥物加入時(shí)，同時(shí)加入3H-TdR 7.4×104Bq/ml，12 h后吸棄上清液，二蒸水沖洗，加10%三氯乙酸洗5 min，加0.3 mol/L NaOH處理30 min，多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞裂解液至玻璃纖維濾紙上，烤干。將玻璃纖維濾紙置于閃爍計(jì)數(shù)管中，每管加入閃爍液0.5 ml，液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射性，結(jié)果以cpm值表示。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析 收集不同條件處理的CFs，全細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 000 r/min離心去除沉淀，BCA試劑測(cè)定蛋白含量。1×SDS凝膠加樣緩沖液調(diào)蛋白濃度使各組一致，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。收集CFs與等體積2×電泳加樣緩沖液混合后，煮沸5 min，每泳道上樣10 μl。采用蛋白提取液提取總蛋白，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白含量。灌制15%的分離膠和4%積層膠，取每組細(xì)胞100 μg(20 μl)蛋白加入上樣孔，90 V恒壓垂直電泳2 h后，取出凝膠，在BioRad轉(zhuǎn)移槽中28 mA恒流濕轉(zhuǎn)18 h后，取出PVDF膜進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)(cav1一抗稀釋濃度為1∶1 000，二抗為1∶3 000)。為觀察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況，對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行麗春紅S染色，觀察完畢后用去離子水將染液漂洗干凈，DAB顯色，待顯色適度時(shí)，用水漂洗終止顯色反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)掃描，軟件分析計(jì)算A值。erk 1/2抗體、p-erk1/2抗體、p21抗體、cyclin A抗體免疫印跡步驟同上，抗體濃度參照試劑說(shuō)明書。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組 (1)空白對(duì)照組:無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液;(2)AVP組;(3)Sim組;(4)cav1反義鏈單獨(dú)作用組;(5)cav1錯(cuò)義鏈單獨(dú)作用組;(6)cav1反義鏈+AVP組;(7)cav1錯(cuò)配鏈+AVP組;(8)MβCD 組;(9)Pro組;(10)15 μg/ml膽固醇組;(11)Pro+15 μg/ml膽固醇組;(12)MβCD+15 μg/ml膽固醇組;(13)Sim+膽固醇組:又分為Sim+10 μg/ml膽固醇組亞組、Sim+15 μg/ml膽固醇組亞組、Sim+20 μg/ml膽固醇組亞組;用DMEM調(diào)整AVP終濃度為1×10－7mol/L，Sim終濃度為10－7mol/L，cav1-AS ODN 終濃度為 5 μmol/L。每組設(shè)6～8個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 cav1反義寡核苷酸對(duì)大鼠CFs的DNA合成的影響cav1反義和錯(cuò)義寡核苷酸分別導(dǎo)入大鼠CFs并孵育24 h后，大鼠CFs內(nèi)3H-TdR摻入率分別相當(dāng)于空白對(duì)照組(100±5)%的(157±7)%和(95±5)%，其中反義寡核苷酸組與空白對(duì)照組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。錯(cuò)義寡核苷酸組與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在10－7mol/L的AVP單獨(dú)干預(yù)CFs 24 h后，大鼠CFs內(nèi)3H-TdR摻入率相當(dāng)于空白對(duì)照組的(172±4)%，與空白對(duì)照組相比，差異非常顯著(P＜0.01)。將 cav1反義或錯(cuò)義寡核苷酸分別與10－7mol/L的AVP共同干預(yù)CFs 24 h后，大鼠CFs內(nèi)3H-TdR酸摻入率分別相當(dāng)于空白對(duì)照組的(212±6)%和(170±3)%，其中反義寡核苷酸+10－7mol/L的AVP共同干預(yù)組與10－7mol/L的AVP單獨(dú)干預(yù)組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。錯(cuò)義寡核苷酸+10－7mol/L的AVP共同干預(yù)組與10－7mol/L的AVP單獨(dú)干預(yù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 cav1反義寡核苷酸對(duì)大鼠CFs內(nèi)erk1/2 MAPK活性的影響 cav1反義和錯(cuò)義寡核苷酸分別干預(yù)大鼠CFs 5 min后，大鼠CFs內(nèi)p-erk1/2蛋白表達(dá)量分別相當(dāng)于空白對(duì)照組的(2.3±0.3)倍和(1.1±0.2)倍，其中反義寡核苷酸組與空白對(duì)照組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。錯(cuò)義寡核苷酸組與空白對(duì)照組比較無(wú)差異(P＞0.05)。10－7mol/L的AVP單藥干預(yù)CFs 5 min后，CFs內(nèi)p-erk1/2蛋白表達(dá)量相當(dāng)于空白對(duì)照組的(5.7±0.2)倍，與空白對(duì)照組相比，差異非常顯著(P＜0.01)。將cav1反義或錯(cuò)義寡核苷酸分別與10－7mol/L的AVP共同干預(yù)CFs 5 min后，大鼠CFs內(nèi)p-erk1/2蛋白表達(dá)量分別相當(dāng)于空白對(duì)照組的(7.9±0.3)倍和(5.5±0.2)倍，其中反義寡核苷酸+10－7mol/L的AVP共同干預(yù)組與10－7mol/L的AVP單獨(dú)干預(yù)組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。錯(cuò)義寡核苷酸+10－7mol/L的AVP共同干預(yù)組與10－7mol/LAVP單獨(dú)干預(yù)組比較無(wú)差異(P＞0.05)。見圖1。

2.3 cav1反義寡核苷酸對(duì)大鼠CFs內(nèi)p21和細(xì)胞周期蛋白A蛋白表達(dá)的影響 在用cav1反義寡核苷酸單獨(dú)干預(yù)或者與10－7mol/L的 AVP共同干預(yù)大鼠CFs 24 h后，兩組CFs內(nèi)p21蛋白表達(dá)強(qiáng)度分別較對(duì)照組下降，細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)強(qiáng)度升高。見圖2。

圖1 cav1反義寡核苷酸對(duì)大鼠CFs內(nèi)erk1/2 MAPK活性的影響

圖2 cav1反義寡核苷酸對(duì)大鼠CFs內(nèi)p21和細(xì)胞周期蛋白A蛋白表達(dá)的影響

2.4 膽固醇對(duì)大鼠CFs胞膜上cav1蛋白表達(dá)的影響 用2%的MβCD或10 μg/ml Pro或10－7mol/L Sim干預(yù)大鼠CFs 24 h后，CFs胞膜上cav1蛋白表達(dá)量分別相當(dāng)于對(duì)照組(100±5)%的(61±3)%、(61±2)%和(66±4)%，與對(duì)照組比較，差異均非常顯著(P＜0.01)。

用15 μg/ml的膽固醇分別與2%的MβCD或10 μg/ml Pro共同干預(yù)CFs 24 h后，CFs胞膜上cav1蛋白表達(dá)量分別相當(dāng)于對(duì)照組的 (86±2)%和 (86±3)%，與2%的MβCD或10 μg/ml Pro單獨(dú)作用組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均非常顯著 (P＜0.01)。用10、15或 20 μg/ml膽固醇分別與 10－7mol/L Sim共同干預(yù)CFs 24 h后，CFs胞膜上cav1蛋白表達(dá)量分別相當(dāng)于對(duì)照組的 (86±3)%、 (91±4)%和 (94±5)%，其中10 μg/ml膽固醇和 10－7mol/L Sim 共同干預(yù)與 10－7mol/L Sim單獨(dú)作用組比較，差異顯著 (P＜0.05)，15 μg/ml或20 μg/ml膽固醇+10－7mol/L Sim共同干預(yù)組與10－7mol/L Sim單獨(dú)作用組比較，差異均非常顯著 (P＜0.01)。15 μg/ml膽固醇單獨(dú)干預(yù)CFs 24 h后，CFs胞膜上cav1蛋白表達(dá)量相當(dāng)于對(duì)照組的 (119±5)%，與對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著 (P＜0.05)。見圖3。

圖3 膽固醇對(duì)cav1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是近年來(lái)細(xì)胞生物學(xué)研究中的主要領(lǐng)域，心臟重構(gòu)機(jī)制也與之關(guān)系十分密切。這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程首先是在生物膜上進(jìn)行的，而究竟是在生物膜的什么部位，目前還不十分清楚。研究證實(shí)，細(xì)胞膜上小窩結(jié)構(gòu)是許多信號(hào)分子完成跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“驛站”，小窩蛋白是小窩結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性蛋白，可與信號(hào)分子直接接觸，調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能狀態(tài)〔7〕。文獻(xiàn)還報(bào)道，絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)中，erk1/2信號(hào)通路的上游蛋白R(shí)as、Raf-1和 erk1/2本身定位于小窩區(qū)域〔8〕。研究已證實(shí)，AVP可通過(guò)其V1受體誘導(dǎo)新生大鼠CFs增殖〔9〕，從而具有一定的促纖維化作用。本研究結(jié)果表明，AVP可活化erk1/2，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)，并抑制細(xì)胞周期蛋白抑制因子p21的表達(dá)，從而豐富了對(duì)AVP促增殖作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本研究采用cav1-AS ODN導(dǎo)入細(xì)胞后，可與編碼cav1的雙鏈或單鏈DNA結(jié)合，抑制剪接或降解目的mRNA，阻斷翻譯起始過(guò)程，也就是作用于cav1遺傳信息傳遞的各個(gè)步驟發(fā)揮其反義作用。研究表明，cav1-AS ODN對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)及AVP誘導(dǎo)的CFs增殖起促進(jìn)作用，從而提示，升高cav1蛋白的表達(dá)水平可能會(huì)抑制AVP誘導(dǎo)的CFs增殖，進(jìn)而發(fā)揮抗心肌纖維化作用。同時(shí)，小窩是細(xì)胞膜上富含膽固醇和鞘脂的膜微區(qū)，膽固醇對(duì)于維持小窩的完整性是必需的，是細(xì)胞內(nèi)多種負(fù)性信號(hào)分子的錨定部位和信號(hào)分子對(duì)話(cross-talk)的重要場(chǎng)所，膽固醇對(duì)于維持小窩的完整及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要作用〔5〕。黃體酮也有類似作用，并且主要影響小窩內(nèi)的膽固醇水平。本研究用β-甲基環(huán)糊精和黃體酮干擾了細(xì)胞膜上的膽固醇水平后，cav1的表達(dá)減少，影響了小窩形成，進(jìn)而干擾了小窩內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

目前關(guān)于他汀類藥物抗纖維化機(jī)制研究正處于初步認(rèn)識(shí)階段，已經(jīng)明確他汀類藥物對(duì)血清膽固醇水平正常的高血壓病患者有一定的降壓作用，可間接改善心肌的肥厚〔10〕，一方面與降低內(nèi)源性膽固醇水平有關(guān)，另一方面可能抑制甲羥戊酸及類異戊二烯的合成，影響小G蛋白的成熟、定位和激活，從而阻斷MAPK途徑的激活等作用有關(guān)。然而，已研究表明類異戊二烯化在細(xì)胞膜上的網(wǎng)格蛋白而不是小窩內(nèi)完成〔11〕。本研究表明Sim通過(guò)降低細(xì)胞膜上膽固醇水平，減少了cav1的表達(dá)水平。在增加細(xì)胞膜上的膽固醇水平后，cav1表達(dá)增加，可與Sim共同對(duì)erk 1/2增殖信號(hào)起負(fù)性調(diào)控作用。因此，對(duì)血清膽固醇水平正常的高血壓病患者在服用他汀類藥物的同時(shí)，適當(dāng)?shù)卦黾幽懝檀碱愇镔|(zhì)的攝入可能有利于他汀類藥物的抗心肌纖維化作用。

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