RNAi沉默N－cadherin表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響*

李 克， 劉 鶯， 劉文靜， 侯新芳， 何素英， 王居峰

(河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450008)

食管癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)特別是河南等省份是食管癌的高發(fā)地區(qū)［1，2］，其死亡率居惡性腫瘤的第4位。由于侵襲、轉(zhuǎn)移是引起食管癌患者死亡的主要原因，因此對(duì)食管癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的探討已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

鈣黏附蛋白家族(cadherin family)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中以上皮型鈣黏附蛋白(E-cadherin)和神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)分布最廣泛。國(guó)內(nèi)外已有研究表明，食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移與E-cadherin的低表達(dá)或不表達(dá)有關(guān)。最近研究表明，在前列腺癌和乳腺癌中N-cadherin表達(dá)增多，并且在引起腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面有著比E-cadherin 減少更為重要的作用［3，4］。N-cadherin 對(duì)于腫瘤上皮細(xì)胞及表達(dá) N-cadherin的血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附起著重要作用。在腫瘤形成過(guò)程中，N-cadherin的表達(dá)有助于血管形成及上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞的遷移，從而使腫瘤細(xì)胞更加富于侵襲性，易于轉(zhuǎn)移［5］。此外，N-cadherin還是一種凋亡抑制因子，可以通過(guò)抑制凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。如前文所述［6］，本研究首先通過(guò)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織中E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)及其與臨床病理諸因素的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)人食管鱗狀細(xì)胞癌組織中E-cadherin的低表達(dá)和N-cadherin的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān);然后又通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，降低人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞中N-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn):RNAi沉默N-cadherin表達(dá)可以使EC9706細(xì)胞的體外侵襲力顯著降低，從而提示N-cadherin與食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移可能是N-cadherin和MMP-9共同作用的結(jié)果。因此，本研究通過(guò)荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)，將RNA干擾前后的EC9706細(xì)胞通過(guò)皮下注射的方式接種于裸鼠體內(nèi)，觀察各組裸鼠成瘤期、成瘤大小、瘤體重量及細(xì)胞凋亡的情況，檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和 MMP-9的表達(dá)，從而為N-cadherin治療食管鱗狀細(xì)胞癌的可行性研究提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

4-6周 BALB/c-nude裸鼠15只，雌性，平均體重16-18 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。pEGFP-MSCVneo質(zhì)粒和 pMSCVneo/N-cadherin質(zhì)粒由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)馬杰博士饋贈(zèng)。pMSCVneo/N-cadherin質(zhì)粒大小為7.5 kb，內(nèi)含EGFP基因序列、U6啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)等。人食管癌細(xì)胞株EC9706由中科院提供;包裝細(xì)胞株P(guān)T67購(gòu)自Clontech;E-cadherin、N-cadherin和 MMP-9Ⅰ抗(鼠抗人單克隆抗體)購(gòu)自Abcam;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM購(gòu)自Invitrogen;TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNAi沉默N-cadherin基因在EC9706細(xì)胞中的表達(dá)

①脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞PT67及抗性克隆的篩選與擴(kuò)增 將病毒包裝細(xì)胞PT67接種至6孔培養(yǎng)板中，待其融合達(dá)90%-95%時(shí)，用脂質(zhì)體法對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染(具體方法見(jiàn) LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū))。轉(zhuǎn)染共分4組:正常對(duì)照組﹑脂質(zhì)體組和pEGFP-MSCVneo質(zhì)粒組﹑pMSCVneo/N-cadherin質(zhì)粒組。

選用G418進(jìn)行抗性克隆的篩選和擴(kuò)增，初選濃度為1000 mg/L(由預(yù)實(shí)驗(yàn)得出)，10-15 d后降為300 mg/L，繼續(xù)維持10-15 d。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞每隔3-4 d在倒置熒光顯微鏡下488 nm波長(zhǎng)處觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。

②病毒滴度的測(cè)定 從pEGFP-MSCVneo質(zhì)粒組、pMSCVneo/N-cadherin質(zhì)粒組經(jīng)G418篩選形成的PT67抗性克隆中，分別挑取2個(gè)邊界清楚的克隆進(jìn)行擴(kuò)增，收集病毒上清用以感染NIH3T3細(xì)胞，并用G418(600 mg/L)加壓篩選，用未感染的NIH3T3細(xì)胞作對(duì)照。2周后計(jì)算每瓶?jī)?nèi)的克隆數(shù)，按下式計(jì)算病毒滴度。病毒滴度(cfu/L)=克隆數(shù)/［病毒原液的體積(L)×復(fù)制因子×稀釋度］。選取病毒滴度最高的病毒上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

③EC9706細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及抗性克隆的篩選與擴(kuò)增將EC9706細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板中，待其融合達(dá)90%-95%時(shí)，進(jìn)行感染，感染共分3組:正常對(duì)照組﹑pEGFP-MSCVneo病毒上清組(空載體組)﹑pMSCVneo/N-cadherin病毒上清組(干擾載體組)，方法與病毒滴度測(cè)定相同，篩選出具有G418抗性的EC9706細(xì)胞克隆，并用含G418(300 mg/L)的條件培養(yǎng)基進(jìn)行維持培養(yǎng)。

2.2 裸鼠異種腫瘤接種實(shí)驗(yàn)

①EC9706細(xì)胞懸液的制備 大量擴(kuò)增并收獲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常對(duì)照組、空載體組和干擾載體組EC9706細(xì)胞，用不含 Ca2+、Mg2+的 PBS液(0.01 mol/L，pH 8.0)洗滌2次并制備成1×1010cells/L的細(xì)胞懸液。

②動(dòng)物準(zhǔn)備及腫瘤細(xì)胞接種 將15只裸鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、空載體組和干擾載體組，每組各5只。將裸鼠常規(guī)消毒后，選取各組裸鼠背部肩胛旁區(qū)作為注射點(diǎn)，分別皮下注射3組EC9706細(xì)胞懸液(1 ×1010cells/L)，0.2 mL/只。

③生長(zhǎng)曲線的繪制 定期觀察裸鼠成瘤情況，每隔7d測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)徑(L)和短徑(S)，根據(jù)公式V(cm3)=L×S2×0.5來(lái)計(jì)算移植瘤的近似體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，計(jì)算成瘤率。

④瘤體終重量和終體積的比較 接種5周后，頸椎脫臼處死裸鼠，完整剝離瘤體，測(cè)量瘤體終體積，并稱(chēng)取瘤重，以計(jì)算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率=(對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%;切除部分新鮮標(biāo)本投入液氮中保存，以備Western blotting實(shí)驗(yàn)所用;剩余腫瘤組織用40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于HE染色、免疫組化及細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

2.3 裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá)

①免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá) 將各組裸鼠移植瘤組織經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4-6 μm。染色方法嚴(yán)格參照免疫組化PV-9000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。胞膜/胞質(zhì)棕黃色染色為陽(yáng)性，其中E-cadherin以胞膜著色為主，N-cadherin和MMP-9以胞質(zhì)染色為主，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野(×400)，觀察200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

②Western blotting檢測(cè)裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá) 研缽常規(guī)消毒后，加入液氮，取約50 mg組織塊研磨，磨碎后加入適量(約200 μL)蛋白裂解液，繼續(xù)研磨至粉末，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的EP管中，待粉末溶化后，1500×g離心30 min，去上清轉(zhuǎn)移至一新的EP管中，即為組織蛋白。嚴(yán)格參照Western blotting試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用β-actin抗體作為上樣對(duì)照。Western blotting結(jié)果的灰度值分析采用Gene Tools軟件完成。

2.4 凋亡的原位酶標(biāo)記檢測(cè)(TUNEL法) 將石蠟包埋的組織切片預(yù)處理后，嚴(yán)格參照TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，同時(shí)設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照。以背景無(wú)顏色，細(xì)胞核內(nèi)著棕黃色顆粒為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野(×400)，觀察200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNAi沉默N－cadherin基因在EC9706細(xì)胞中的表達(dá)

1.1 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞PT67及陽(yáng)性克隆的篩選與擴(kuò)增 轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下488 nm波長(zhǎng)處觀察，pEGFP-MSCVneo質(zhì)粒組、pMSCVneo/N-cadherin質(zhì)粒組PT67細(xì)胞均可見(jiàn)明亮的綠色熒光，胞漿和胞核都有，正常對(duì)照組、脂質(zhì)體組未見(jiàn)綠色熒光。20-30 d后正常對(duì)照組、脂質(zhì)體組細(xì)胞全部死亡，從而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PT67細(xì)胞。

1.2 病毒滴度的測(cè)定 pEGFP-MSCVneo質(zhì)粒組PT67細(xì)胞克隆1和2的病毒滴度分別為6×107cfu/L和 1×107cfu/L，pMSCVneo/N-cadherin質(zhì)粒組PT67細(xì)胞克隆1和2的病毒滴度分別為2×107cfu/L和8×107cfu/L，遂選擇pEGFP-MSCVneo質(zhì)粒組PT67細(xì)胞克隆1和pMSCVneo/N-cadherin質(zhì)粒組PT67細(xì)胞克隆2的病毒上清對(duì)EC9706進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 EC9706的轉(zhuǎn)染及抗性克隆的篩選與擴(kuò)增 將病毒上清轉(zhuǎn)染EC970624 h后，空載體組及干擾載體組即可見(jiàn)綠色熒光，胞漿和胞核都有，而正常對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光。當(dāng)G418以600 mg/L的初選濃度作用5-7 d后，正常對(duì)照組細(xì)胞絕大部分死亡，然后將G418濃度降為300 mg/L維持，10-15 d后正常對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，而空載體組及干擾載體組則形成大小不一的抗性克隆，后續(xù)培養(yǎng)中仍用含300 mg/L G418的條件培養(yǎng)基維持。

2 荷瘤裸鼠異種腫瘤接種實(shí)驗(yàn)

2.1 人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞異種移植瘤動(dòng)物模型的建立 正常對(duì)照組、空載體組裸鼠均于接種后第7-8 d左右的時(shí)間出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的瘤體，而干擾載體組裸鼠出瘤時(shí)間較前2組延長(zhǎng)大2-4 d。瘤體起初為橢圓形，以后生長(zhǎng)漸不規(guī)則，凸凹不平。接種5周后，處死裸鼠并迅速測(cè)量瘤體體積和重量，見(jiàn)圖1。與正常對(duì)照組、空載體組相比，干擾載體組裸鼠移植瘤體積和重量均明顯減小，差異顯著(P＜0.05)?？蛰d體組的腫瘤抑制率為6.89%，而干擾載體組的腫瘤抑制率為79.52%。解剖學(xué)檢查各組沒(méi)有明顯差別，瘤體有完整包膜，未見(jiàn)腫瘤向周?chē)M織侵襲，全身未見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)不易找到，無(wú)胸腺，肺臟無(wú)栓塞。心、肝、脾、腎等器官肉眼觀察無(wú)異常。

Figure 1.Effect of N－cadherin knock-down on EC9706 tumor growth in nude mice.A:photograph of nude mice at the 5th week;B:photograph of tumor tissues in nude mice at the 5th week;C:down-regulation of N-cadherin reduced the volumes of tumor tissues in N-cadherin RNAi group at the 5th week;D:down-regulation of N-cadherin reduced the weights of tumor tissues in N-cadherin RNAi group at the 5th week..n=5.*P＜0.05 vs untreated and control vector groups.圖1 RNA干擾沉默N－cadherin表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響

2.2 生長(zhǎng)曲線的繪制 接種后定期觀察各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況，每7 d測(cè)量1次裸鼠瘤體體積，然后繪制其生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示:干擾載體組裸鼠瘤體生長(zhǎng)緩慢且瘤體體積顯著小于正常對(duì)照組和空載體組，組間比較差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The grouth curves of tumor tissues in the 3 groups of nude mice..n=5.＊＊P＜0.01 vs untreated and control vector groups.圖2 3組裸鼠移植瘤體積生長(zhǎng)曲線

2.3 裸鼠移植瘤的組織學(xué)觀察 3組裸鼠移植瘤組織HE染色后，光鏡下觀察可見(jiàn)大小不等的瘤細(xì)胞團(tuán)，其中散在灶狀、片狀凝固性壞死，瘤細(xì)胞多為圓形或多角形上皮樣細(xì)胞，大小不一，排列緊密，核染色質(zhì)致密，染色深，異型性明顯，部分腫瘤細(xì)胞病理性核分裂像可見(jiàn)。瘤細(xì)胞團(tuán)周?chē)猩倭坷w維結(jié)締組織包繞，未見(jiàn)色素顆粒，見(jiàn)圖3。

3 3 組裸鼠移植瘤組織中E－cadherin、N－cadherin和MMP－9蛋白的表達(dá)

3.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá) 3組裸鼠移植瘤組織均見(jiàn)到E-cadherin蛋白陽(yáng)性染色，呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞膜，3組比較差異無(wú)顯著(P＞0.05);正常對(duì)照組和空載體組裸鼠腫瘤組織中可見(jiàn)到N-cadherin和MMP-9蛋白陽(yáng)性染色，呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，而干擾載體組中N-cadherin和MMP-9蛋白的陽(yáng)性染色較弱，與正常對(duì)照組和空載體組比較，差異均顯著(P ＜0.05)，見(jiàn)表1、圖4。

3.2 Western blotting檢測(cè)3組裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá) 正常對(duì)照組、空載體組和干擾載體組3組裸鼠腫瘤組織中E-cadherin的蛋白表達(dá)比較，無(wú)顯著差異(P＞0.05);正常對(duì)照組和空載體組2組裸鼠腫瘤組織中N-cadherin的蛋白表達(dá)相比無(wú)明顯變化(P＞0.05)，而干擾載體組中N-cadherin的蛋白表達(dá)與以上2組相比則明顯降低(P＜0.05);正常對(duì)照組和空載體組2組裸鼠腫瘤組織中MMP-9的蛋白表達(dá)相比無(wú)明顯變化(P＞0.05)，而干擾載體組中MMP-9的蛋白表達(dá)與以上2組相比則明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 3.HE staining of tumor tissue in the 3 groups of nude mice(×400).圖3 3組裸鼠移植瘤組織的HE染色結(jié)果

表1 3組裸鼠移植瘤組織中E－cadherin、N－cadherin和MMP－9蛋白表達(dá)的比較Table 1.Comparision of E-cadherin，N-cadherin and MMP-9 protein expression in the 3 groups of nude mice

Figure 4.Expression of E-cadherin，N-cadherin and MMP-9 proteins in the 3 groups of nude mice(×400).圖4 3組裸鼠移植瘤組織中E－cadherin、N－cadherin和MMP－9蛋白的表達(dá)

Figure 5.Western blotting analysis for N-cadherin，E-cadherin and MMP-9 expression in nude mice.1:untreated group;2:control vector group;3:N-cadherin RNAi group..n=5.*P＜0.05 vs untreated and control vector groups.圖5 3組裸鼠移植瘤組織中E－cadherin、N－cadherin和MMP－9的蛋白表達(dá)

4 裸鼠移植瘤組織中細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

凋亡的原位酶標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，干擾載體組凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，與正常對(duì)照組和空載體組相比差異顯著(P＜0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 6.Apoptosis analysis of tumor tissues in the 3 groups of nude mice(TUNEL，×200)..n=5.*P＜0.05 vs untreated and control vector groups.圖6 3組裸鼠移植瘤組織中細(xì)胞凋亡情況

討 論

E-cadherin和N-cadherin不僅在介導(dǎo)鈣離子依賴的同型細(xì)胞間的黏附中發(fā)揮作用，而且在細(xì)胞遷移和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面也有著重要作用。許多研究表明，E-cadherin是作為一種抑癌基因發(fā)揮作用的［7］。而最近研究表明，和 E-cadherin相反，N-cadherin在促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。

為了研究RNAi沉默N－cadherin表達(dá)對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞體內(nèi)生物學(xué)行為的影響，我們將轉(zhuǎn)染前后的EC9706細(xì)胞大量擴(kuò)增、收集后分別種植于裸鼠皮下，成功建立EC9706細(xì)胞異種移植瘤動(dòng)物模型，該模型為進(jìn)一步研究N-cadherin與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系奠定了良好基礎(chǔ)。接種5周后，處死裸鼠并分離瘤體，分別行3組裸鼠移植瘤體積和重量的組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常對(duì)照組、空載體組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而干擾載體組與以上2組相比，組間比較差異顯著(P＜0.05)。這提示，RNAi沉默 N－cadherin表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)有顯著抑制作用。

本研究聯(lián)合運(yùn)用免疫組織化學(xué)法和Western blotting方法比較了3組裸鼠移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示:3組裸鼠皮下移植瘤中E-cadherin蛋白的表達(dá)無(wú)顯著差異;而與正常對(duì)照組和空載體組相比，干擾載體組N-cadherin和MMP-9蛋白的表達(dá)明顯減弱。這提示，干擾載體組EC9706細(xì)胞移植于裸鼠體內(nèi)后，N-cadherin和MMP-9蛋白仍維持低表達(dá)，RNA干擾沉默N－cadherin表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)MMP-9的表達(dá)，降低細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，進(jìn)而降低EC9706細(xì)胞的體內(nèi)侵襲力。

已有多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明［8-10］，N-cadherin的異常高表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。Li等［11］發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細(xì)胞中N-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附可以激活A(yù)kt/PKB通路，而導(dǎo)致預(yù)凋亡蛋白Bad失活和穩(wěn)定態(tài)β-catenin的聚集，最終促進(jìn)癌細(xì)胞的存活。Tran 等［12］發(fā)現(xiàn)，在前列腺腫瘤中，N-cadherin/catenin黏著復(fù)合體可以通過(guò)一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而增加轉(zhuǎn)移過(guò)程中癌細(xì)胞的生存能力。Makrigiannakis等［13］發(fā)現(xiàn)，抑制N-cadherin功能的抗N-cadherin抗體可以誘導(dǎo)表達(dá)N-cadherin的卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡。Gwak等［14］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)反義載體轉(zhuǎn)染抑制N-cadherin的功能后，與對(duì)照組相比，肝癌細(xì)胞在膽汁酸作用下更容易發(fā)生凋亡。Jiang等［15］發(fā)現(xiàn)，表達(dá)TIP30腫瘤抑制因子突變型(可以保護(hù)細(xì)胞抵抗順鉑誘導(dǎo)的凋亡)的人肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)化療不敏感，但如果運(yùn)用RNA干擾技術(shù)沉默N－cadherin的表達(dá)，這類(lèi)細(xì)胞又重新獲得了對(duì)順鉑的敏感性。以上研究結(jié)果均表明，N－cadherin是一種凋亡抑制因子，可以通過(guò)抑制凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用TUNEL法比較了3組裸鼠移植瘤組織中細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示:干擾載體組裸鼠移植瘤組織中凋亡的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加。這提示，RNAi沉默N－cadherin表達(dá)可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制EC9706細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)。

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