吲哚美辛通過Akt/GSK3β/NAG－1信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡*

龐瑞萍， 胡品津， 曾志榮， 陳 為

(中山大學(xué)1中山醫(yī)學(xué)院生理教研室，2第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

流行病學(xué)研究表明長期使用非甾體類消炎藥(non －steroidal anti－ inflammatory drugs，NSAIDs)可預(yù)防結(jié)腸癌、食管癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生［1，2］。許多臨床前實驗也證實此觀點［3，4］。盡管目前NSAIDs在消化道腫瘤防治中的作用已被廣泛認(rèn)可，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為NSAIDs是通過抑制環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)而發(fā)揮抑制腫瘤的作用，但越來越多的研究表明非COX依賴途徑在其中也發(fā)揮了很重要的作用［5］?，F(xiàn)已證實，除COX外，還有10多個靶點可介導(dǎo)NSAIDs的作用［6］，如核因子 κB(nuclear factor κB，NF － κB)、3 － 磷酸肌醇依賴性激酶1(3－phosphoinositide－dependent kinase 1，PDK1)/Akt、過氧化物酶體增殖子活化受體(peroxisome proliferator － activated receptor，PPAR)、NSAID活化基因(non－steroidal anti－inflammatory drug－activated gene，NAG－1)等。其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/Akt(phosphatidylinositol 3－kinase/protein kinase B/Akt，PI3K/PKB/Akt)通路既可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活，又可以調(diào)節(jié)糖原合成，而這些都是腫瘤預(yù)防和治療的重要靶點［7，8］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)COX抑制劑可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡［9］;在體實驗表明COX抑制劑可明顯抑制大鼠胃腺癌的發(fā)生［10］。進(jìn)一步研究我們發(fā)現(xiàn)，COX抑制劑的上述作用與COX－2的表達(dá)并無明顯關(guān)系［9，11］。本研究從細(xì)胞學(xué)角度觀察吲哚美辛對胃癌細(xì)胞株生長的作用，并在此基礎(chǔ)上探討了吲哚美辛的作用與Akt/GSK3β/NAG－1信號通路的關(guān)系。

材料和方法

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株MGC－803由中科院上海細(xì)胞所贈送。細(xì)胞用含10%新生小牛血清(Hyclone)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。以0.125%胰蛋白酶+0.020%EDTA(Sigma)消化傳代。

1.2 蛋白表達(dá)的檢測 蛋白表達(dá)測定按我們已報道的方法進(jìn)行［9］。即細(xì)胞經(jīng)各種處理后，用冰浴的PBS洗滌2遍，隨后加入裂解緩沖液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris － HCl，1 g/L SDS，0.2 g/L NaN3，5 mg/L aprotinin，1.0 mmol/L PMSF，1.0 g/L NP40，5.0 g/L 脫氧膽酸鈉，pH 8.0)，混勻后冰浴30 min，刮取細(xì)胞。樣品經(jīng)4℃、12000×g離心5 min后，取上清即蛋白提取液。蛋白定量后分別通過SDS－PAGE電泳分離蛋白和電轉(zhuǎn)使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用PBST洗脫P(yáng)VDF膜5 min后，室溫下封閉1 h。加入不同稀釋的Ⅰ抗，室溫溫育2 h或4℃過夜。經(jīng)PBST洗3次后加入相對應(yīng)的Ⅱ抗，室溫孵育2 h。PBST洗脫后經(jīng)曝光、顯影和定影，吸光度值(absorbance，A)通過凝膠成像系統(tǒng)及相應(yīng)軟件分析。

1.3 MTT法測定吲哚美辛對胃癌細(xì)胞活力的影響按我們已報道的方法進(jìn)行［9］。將細(xì)胞(105cells/well)接種于96孔板，24 h后，依不同處理因素處理相應(yīng)時間后，加入5 g/L MTT(四甲基偶氮唑鹽，上海生物工程公司)10 μL/well，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育，4 h后吸去培養(yǎng)基，加入 DMSO(Sigma)100 μL/well，置酶標(biāo)儀上(測定波長570 nm)測定A值。細(xì)胞活力(%)=(處理組A值－空白組A值)/(對照組A值－空白組A值)×100%。

1.4 吲哚美辛誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的檢測 細(xì)胞凋亡檢測按我們已報道的方法進(jìn)行［9］。①Hoechst 33258核染色法 細(xì)胞經(jīng)處理后，用多聚甲醛液(40 g/L，Sigma)固定10 min，蒸餾水洗滌后加入5 mg/L Hoechst33258(Promega)，10 min后蒸餾水洗細(xì)胞2次，自然干燥后，細(xì)胞置于熒光顯微鏡下(340 nm激發(fā)光)觀察并拍照。②流式細(xì)胞儀檢測 細(xì)胞(1×109/L)用PBS洗2次，以70%乙醇(4℃)固定過夜。離心棄乙醇，細(xì)胞重懸于含有50 mg/L碘化丙啶和50 mg/L RNase A的染色液中避光染色30 min。以流式細(xì)胞儀測定，每樣品計數(shù)12000個細(xì)胞，記錄熒光強(qiáng)度值并以相應(yīng)軟件處理結(jié)果，計算凋亡率。

2 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 吲哚美辛對胃癌細(xì)胞株MGC－803活力的影響

MTT檢測結(jié)果顯示100－600 μmol/L吲哚美辛處理MGC－803細(xì)胞12、24和48 h后，細(xì)胞的活力隨劑量增加和時間延長而降低，見圖1。

Figure 1.Effects of indomethacin on viability of MGC－803 cells.MGC －803 cells were treated with indomethacin(100 －600 μmol/L)or DMSO vehicle(0.1%)for 12，24 and 48 h.The cell viability showed a concentration－and time－dependent reduction..n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DMSO.圖1 吲哚美辛對MGC－803細(xì)胞活力的影響

2 吲哚美辛誘導(dǎo)MGC－803細(xì)胞的凋亡

Hoechst 33258核染色法結(jié)果表明，未加吲哚美辛的MGC－803細(xì)胞，胞核較大，淺染，呈彌散均勻熒光;500 μmol/L吲哚美辛處理12 h后胞核形態(tài)變得不規(guī)則，呈條紋狀或裂隙狀，并見部分細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮;處理24 h后染色質(zhì)進(jìn)一步凝集;處理48 h后，可見染色質(zhì)裂解呈塊狀，見圖2。

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)500 μmol/L吲哚美辛處理后各組均出現(xiàn)明顯的凋亡峰。對照組細(xì)胞凋亡百分率為(3.9±1.6)%，吲哚美辛處理12、24和48 h組細(xì)胞凋亡率分別為(19.6±3.5)%、(38.8±6.1)%和(56.6±9.7)%，P ＜0.01，見圖3。

Figure 2.Morphological changes of MGC －803 cells induced by indomethacin(×400).After treated with 500 μmol/L indomethacin for 12，24 and 48 h，apoptotic bodies could be observed under fluorescent microscope.圖2 吲哚美辛作用后MGC－803細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

Figure 3.MGC －803 cell apoptosis after treatment with indomethacin(500 μmol/L)for 12，24 and 48 h analyzed by flow cytometry.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測吲哚美辛處理后MGC－803細(xì)胞的凋亡率

3 吲哚美辛誘導(dǎo)caspase－3的活化

500 μmol/L吲哚美辛處理細(xì)胞12、24和48 h后，caspase－3酶原被激活，蛋白免疫印跡顯示17 kD的活化caspase－3片段，其作用存在時間依賴性，見圖4A。廣譜caspase抑制劑zVAD－fmk 100 μmol/L可明顯抑制吲哚美辛引起的caspase－3酶原的活化，見圖4B。而且zVAD－fmk 100 μmol/L預(yù)處理后可顯著降低吲哚美辛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，見圖4C。這提示吲哚美辛主要通過caspase通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。

Figure 4.Effects of z－VAD－fmk on indomethacin－induced apoptosis.MGC －803 cells were treated with 500 μmol/L indomethacin for 6，12 and 24 h(A)or 24 h in the presence or absence of 100 μmol/L z－VAD－fmk(z－VAD －fmk was added to the cells 2 h prior to indomethacin treatment;DMSO vehicle concentration:0.1%)(B).Proteins were extracted and used for the detection of caspase－3 cleavage by Western blotting.C:indomethacin－induced reduction of cell viability was partially prevented by pretreatment with z－VAD－fmk.Indo:indomethacin..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs indomethacin group.圖4 廣譜caspase抑制劑z－VAD－fmk對吲哚美辛誘導(dǎo)MGC－803細(xì)胞凋亡的作用

4 吲哚美辛對Akt和GSK3β磷酸化的影響

吲哚美辛(500 μmol/L)作用于MGC－803細(xì)胞后，總Akt蛋白表達(dá)無明顯變化，而Ser473位點磷酸化Akt的表達(dá)水平明顯降低，見圖5A、C。

吲哚美辛作用后，細(xì)胞總GSK3β的表達(dá)無顯著變化，而GSK3β Ser9磷酸化水平降低，見圖5B、D。

Figure 5.Effects of indomethacin on the phosphorylation of Akt and GSK3β in MGC －803 cells.Indomethacin(500 μmol/L)treatment inhibited the phosphorylation of Akt(Ser473)(A，C)and GSK3β (Ser9)(B，D)in MGC －803 cells，but did not change the total Akt and GSK3β.Indo:indomethacin..n=4.＊＊P＜0.01 vs corresponding control.圖5 吲哚美辛對MGC－803細(xì)胞Akt和GSK3β磷酸化的影響

5 吲哚美辛通過PI3K/Akt/GSK3β信號通路誘導(dǎo)NAG－1的表達(dá)

吲哚美辛可以增加NAG－1的表達(dá)，而單獨應(yīng)用PI3K抑制劑 LY294002(20 μmol/L)和 Akt抑制劑1L－6－h(huán)ydroxymethyl－chiro－inositol 2(R)－2－O －octadecylcarbonate(10 μmol/L)處理后，也可增加NAG－1蛋白表達(dá)。預(yù)先加入 GSK3β抑制劑SB216763(10 μmol/L)孵育1 h可完全取消PI3K抑制劑和Akt抑制劑誘導(dǎo)NAG－1表達(dá)的作用，見圖6A、C。PI3K 抑制劑 LY294002(20 μmol/L)和 Akt抑制劑(10 μmol/L)預(yù)孵育 1 h 后再加入500 μmol/L吲哚美辛，NAG－1的表達(dá)水平與單用吲哚美辛相比無顯著差異。而預(yù)先加入 GSK3β抑制劑SB216763(10 μmol/L)孵育1 h，則完全取消吲哚美辛誘導(dǎo)NAG－1表達(dá)的作用，見圖6B、D。

6 GSK3β抑制劑對吲哚美辛誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

預(yù)先加入SB216763(10 μmol/L)孵育1 h可顯著抑制吲哚美辛誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，見圖7。

Figure 6.Effects of PI3K，Akt and GSK3β inhibitors on NAG －1 expression induced by indomethacin in MGC －803 cells.MGC －803 cells were treated with 20 μmol/L LY294002，a specific PI3K inhibitor，or 10 μmol/L 1L －6 － hydroxymethyl－ chiro － inositol 2(R)－2－O －octadecylcarbonate，a selective Akt inhibitor，or pre－addition of 10 μmol/L SB216763，a selective GSK3β inhibitor for 12 h in the presence(B，D)or absence(A，C)of 500 μmol/L indomethacin.The cell lysates were harvested for Western blotting analysis using anti－NAG－1 antibody..n=5.＊＊P＜0.01 vs control.圖6 PI3K、Akt和GSK3β抑制劑對吲哚美辛誘導(dǎo)MGC－803細(xì)胞NAG－1表達(dá)的影響

Figure 7.GSK3β inhibitor blocks the indomethacin－induced inhibition of cells growth.Indomethacin－induced reduction of cell viability was prevented by pretreatment with 10 μmol/L SB216763(SB216763 was added to the cells 1 h prior to indomethacin treatment;DMSO vehicle concentration:0.1%).Indo:indomethacin..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs indomethacin group.圖7 GSK3β抑制劑可阻斷吲哚美辛誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用

討 論

Akt(PKB)是細(xì)胞存活和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，Akt的磷酸化可保護(hù)多種類型細(xì)胞的凋亡。越來越多的證據(jù)顯示Akt可通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［12］。在肺癌和肝癌細(xì)胞，研究表明Akt的磷酸化參與了COX－2介導(dǎo)的促細(xì)胞存活過程［12，13］。Akt的磷酸化位點包括催化結(jié)構(gòu)域的Thr308位點和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的Ser473位點。Thr308位點的磷酸化只能部分激活A(yù)kt，只有2個位點的磷酸化才能使Akt充分活化。已有研究表明，NSAIDs誘導(dǎo)前列腺癌、肝細(xì)胞肝癌等的凋亡作用與抑制Akt Thr308和Ser473位點的磷酸化水平相關(guān)［14，15］。在人結(jié)腸癌細(xì)胞株 HT －29 細(xì)胞，celecoxib誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用同時Akt和GSK3β磷酸化水平均被明顯抑制［16］?；罨蟮腁kt主要通過對含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物磷酸化而發(fā)揮作用。GSK3β是Akt的重要底物之一，它作為細(xì)胞凋亡的上游調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控多種細(xì)胞的凋亡過程［17］。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，GSK3β即有較高的活性。Akt通過磷酸化GSK3β的Ser9而抑制其活性。最近有報道認(rèn)為celecoxib可通過抑制PI3K/Akt/GSK3β通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡［18］。本實驗中，我們在MGC－803細(xì)胞檢測到基礎(chǔ)狀態(tài)Akt Ser473位點和GSK3β Ser9位點的磷酸化，吲哚美辛可明顯抑制 Akt Ser473和GSK3β Ser9的磷酸化水平，而對總的 Akt和總GSK3β表達(dá)水平無影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β選擇性抑制劑 SB216763可幾乎完全逆轉(zhuǎn)吲哚美辛誘導(dǎo)MGC－803細(xì)胞凋亡的作用。這些結(jié)果說明吲哚美辛是通過Akt/GSK3β信號通路誘導(dǎo)MGC－803細(xì)胞凋亡。但GSK3β的信號下游底物尚未明了。

NAG－1又稱為巨噬細(xì)胞抑制因子1(macrophage inhibitory factor 1，MIF－1)、生長分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF－15)等，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF－β)超家族成員。已有的研究表明，NAG－1過表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞、上皮腫瘤細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的增殖［18，19］，而且 NAG －1 過表達(dá)的人結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞種植于裸鼠后，其成瘤能力明顯降低［20，21］。進(jìn)一步研究顯示，NAG－1過表達(dá)可引起前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生 caspase依賴性的凋亡［22］。這些結(jié)果提示NAG－1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。但NAG－1的調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚。已知NSAIDs可誘導(dǎo)NAG－1蛋白表達(dá)的上調(diào)。已有研究認(rèn)為NSAIDs主要是通過早期生長反應(yīng)基因－1(early growth response gene－1，EGR －1)上調(diào) NAG －1的表達(dá)［23］。最近有研究提示 NAG －1的表達(dá)受 PI3K/Akt/GSK3β［24］信號通路調(diào)控。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，在MGC－803細(xì)胞，吲哚美辛可誘導(dǎo)NAG－1的表達(dá)上調(diào)。單用PI3K抑制劑和Akt抑制劑亦可明顯上調(diào)NAG－1的表達(dá)，預(yù)先加入GSK3β抑制劑則完全取消PI3K抑制劑和Akt抑制劑對 NAG－1的作用，提示 PI3K/Akt/GSK3β信號通路參與調(diào)控MGC－803細(xì)胞NAG－1的表達(dá)。我們的結(jié)果與結(jié)腸癌細(xì)胞上的研究結(jié)果相一致［23］。如預(yù)先加入GSK3β抑制劑則可取消吲哚美辛上調(diào)NAG－1表達(dá)的作用，而在PI3K抑制劑和Akt抑制劑作用的基礎(chǔ)上，吲哚美辛對NAG－1表達(dá)的上調(diào)作用與單用吲哚美辛相比并無差異。提示在胃癌細(xì)胞株MGC－803細(xì)胞，吲哚美辛主要是通過Akt/GSK3β信號通路上調(diào)NAG－1的表達(dá)。

綜上所述，我們的結(jié)果表明，在胃癌細(xì)胞株MGC－803細(xì)胞，非選擇性COX抑制劑吲哚美辛主要是通過Akt/GSK3β信號通路上調(diào)NAG－1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

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