芍藥苷減輕小鼠LPS性急性肺損傷的作用機(jī)制研究*

張 斌， 李紅梅， 王 媛， 王發(fā)強(qiáng)， 王一陽(yáng)， 呂秀秀， 戚仁斌， 陸大祥， 王華東

(1中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院胸心外科，廣東 珠海 519000;2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥反應(yīng)、微血管和肺泡上皮彌漫性損傷、肺水腫及肺間質(zhì)纖維化等為病理特征的一種臨床綜合征，嚴(yán)重者即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，可由創(chuàng)傷、肺炎和膿毒癥等引起［1，2］。文獻(xiàn)報(bào)道，高達(dá)40%的膿毒癥患者伴發(fā)ALI/ARDS［3］;膿毒癥的重要致病因子，革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可通過(guò)多種途徑導(dǎo)致 ALI［4，5］;ALI/ARDS 是膿毒癥患者死亡的重要原因［6］。因此，尋找有效策略防治膿毒癥相關(guān)性ALI/ARDS和LPS誘導(dǎo)ALI對(duì)膿毒癥的治療具有重要臨床意義，一直是人們高度關(guān)注的研究領(lǐng)域［7］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷(paeoniflorin，Pae)能顯著降低內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率，抑制LPS誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)，減輕腹腔注射LPS 誘導(dǎo) ALI［8］。隨后，Zhou 等［9］的研究也進(jìn)一步證實(shí)Pae能減輕氣道滴注LPS引起的ALI。然而，Pae減輕LPS誘導(dǎo)ALI的機(jī)制尚缺乏充分研究。研究表明，炎癥細(xì)胞因子、中性粒細(xì)胞與胞漿型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)在腹腔或靜脈注射LPS誘導(dǎo)的 ALI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［2，10-13］，因此，本研究旨在觀察 Pae 對(duì) LPS 攻擊小鼠肺中性粒細(xì)胞聚集及cPLA2活化的影響，以進(jìn)一步闡明Pae減輕內(nèi)毒素性肺損傷的作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性 BALB/c小鼠，6-8周齡，體重21-23 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK(粵)2008-0002。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前置實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)3-4 d，實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度控制在(24±2)℃，相對(duì)濕度為60%-80%。小鼠處理符合暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的相關(guān)規(guī)定。

2 主要試劑與儀器

2.1 主要試劑 LPS(大腸桿菌O55∶B5)購(gòu)自Sigma，芍藥苷(Pae)購(gòu)自廣東省藥品檢驗(yàn)所。小鼠抗小鼠髓過(guò)氧化物酶 (myeloperoxidase，MPO)單克隆抗體購(gòu)自 R＆D;兔抗小鼠甘油醛 -3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自 Cell Signaling Technology;兔抗小鼠cPLA2、磷酸化的胞漿型磷脂酶A2(phospho-cPLA2，Ser505)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗小鼠Ⅱ抗購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限責(zé)任公司。BCA-100蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物公司。

2.2 主要儀器 Western blotting裝置(Bio-Rad);BX40型光學(xué)顯微鏡(Olympus)。

3 方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(control)、(LPS)組、Pae+LPS組(Pae+LPS)、Pae組(Pae)。分別以雙蒸水(0.1 mL/10 g)、Pae(20 mg/kg，0.1 mL/10g)灌胃，1 次/d，連續(xù)3 d，第3 d灌胃后1 h，腹腔注射生理鹽水［normal saline(NS)，0.2 mL/10 g］或 LPS(20 mg/kg，0.2 mL/10 g)。

3.2 肺組織病理學(xué)檢查 腹腔注射N(xiāo)S或LPS后12 h處死小鼠，開(kāi)胸取左肺，固定于4%甲醛溶液中，隨后進(jìn)行石蠟切片及常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)者在光鏡下觀察以下組織學(xué)特征，根據(jù)Su等［14］提出的評(píng)估肺病理?yè)p傷方法，將肺中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺出血分為4級(jí)，0:正常;1:25%的視野有損傷;2:50%的視野有損傷;3:75%的視野有損傷;4:彌漫性肺損傷。肺中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(neutrophil infiltration)和肺出血(hemorrhage)評(píng)分最終結(jié)果以平均秩(mean rank)表示。

3.3 蛋白免疫印跡法檢測(cè)肺組織 MPO、cPLA2及phospho-cPLA2的含量 腹腔注射N(xiāo)S或LPS后12 h處死小鼠，開(kāi)胸取右肺，冰生理鹽水(4℃)沖洗，濾紙吸干，加入0.5 mL的RIPA裂解液(含終濃度為1 mmoL/L的PMSF)，充分勻漿，冰面靜置30 min，13200 r/min離心30 min(4℃)。BCA-100蛋白定量試劑盒檢測(cè)肺組織勻漿液中總蛋白含量。按每個(gè)泳道孔加入70 μg蛋白樣品進(jìn)行10%丙烯酰胺 SDS-PAGE凝膠電泳。Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印儀15 V恒壓轉(zhuǎn)印 18 min至硝酸纖維素膜上。TBST配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜。分別加入1∶1000稀釋的小鼠抗小鼠MPO、兔抗小鼠cPLA2和phospho-cPLA2Ⅰ抗液，以GAPDH為內(nèi)參照，4℃過(guò)夜孵育。加1∶4000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠/兔Ⅱ抗孵育液，室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物含量，BI2000軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值，以MPO/GAPDH和phosphocPLA2/cPLA2積分吸光度比值分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(E)表示，多組間比較用單因素方差分析ANOVA(SNK法)。等級(jí)資料用平均秩表示，兩獨(dú)立樣本比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 肺組織病理學(xué)改變

光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，LPS注射12 h，肺泡間隔明顯增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，明顯肺出血及肺水腫;Pae+LPS組肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出血明顯輕于LPS組;空白對(duì)照組及Pae組肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)出血、水腫，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Representative photomicrograph of lung from mice 12 h after LPS or normal saline injection in control(A)，LPS(B)，Pae+LPS(C)，Pae(D)groups.The lung histological sections were stained with hematoxylin-eosin.Pae:paeoniflorin.Scale bars represent 50 μm.圖1 腹腔注射LPS或生理鹽水后12 h各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變

2 肺組織形態(tài)學(xué)評(píng)分

如圖2所示，LPS注射12 h后，LPS組中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和出血顯著增多;Pae+LPS組肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(4.75 vs 10.60)和出血(4.63 vs 10.80)評(píng)分的平均秩顯著低于LPS組(P＜0.01)。

Figure 2.Histological scores(neutrophil infiltration and hemorrhage)of lung from mice 12 h after LPS or normal saline administration in LPS and Pae+ LPS groups.Pae:paeoniflorin.Values are presented as mean rank.n=8.▲▲P＜ 0.01 vs LPS group.圖2 腹腔注射LPS或生理鹽水后12 h小鼠肺組織形態(tài)學(xué)評(píng)分

3 Pae對(duì)LPS處理小鼠肺組織MPO含量的影響

如圖3所示，小鼠腹腔注射LPS 12 h后，與對(duì)照組相比，LPS組肺組織 MPO含量明顯增加(P＜0.05);事先給予Pae灌胃能顯著抑制LPS引起的小鼠肺組織MPO含量的增加(P＜0.05)。Pae組與正常對(duì)照組相比，肺組織MPO水平未見(jiàn)顯著差異。

Figure 3.Effect of Pae on MPO content in lung tissues 12 h after LPS administration.E.n=6.*P＜0.05 vs control group;▲P＜ 0.05 vs LPS group.圖3 Pae對(duì)LPS處理小鼠肺組織MPO含量的影響

4 Pae對(duì)LPS處理小鼠肺組織cPLA2磷酸化水平的影響

如圖4所示，腹腔注射LPS 12h后，肺組織中磷酸化cPLA2水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，事先給予Pae能顯著抑制LPS引起的cPLA2的磷酸化(P＜0.05)。Pae組與正常對(duì)照組相比，肺組織磷酸化cPLA水平未見(jiàn)明顯差異。

Figure 4.Effect of Pae on phospho-cPLA2protein expression in lung tissues.E.n=6.*P＜0.05 vs control group;▲P＜ 0.05 vs LPS group.圖4 Pae對(duì)LPS處理小鼠肺組織磷酸化cPLA2含量的影響

討 論

本研究中，我們首先觀察小鼠腹腔注射 LPS 12 h后肺組織形態(tài)學(xué)改變。光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，LPS組肺組織損傷明顯，肺泡間隔明顯增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺出血及肺水腫明顯;預(yù)先給予芍藥苷灌胃，可明顯減輕LPS誘導(dǎo)的肺組織損傷，減少肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺出血及肺水腫等。這些結(jié)果表明，Pae可顯著減輕腹腔注射內(nèi)毒素引起的ALI，進(jìn)一步證實(shí)了我們先前報(bào)道的結(jié)果［8］。

Uchiba等［10］發(fā)現(xiàn)，靜脈注射LPS 30 min后大鼠肺組織中即出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞聚集，隨后肺血管通透性明顯增加;用氨甲喋呤減少大鼠血中白細(xì)胞后，LPS誘導(dǎo)的肺血管損傷則明顯減輕。Abraham等［11］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用環(huán)磷酰胺或中性粒細(xì)胞抗體減少中性粒細(xì)胞后，腹腔注射LPS誘導(dǎo)的小鼠肺水腫則明顯減輕，LPS誘導(dǎo)的肺組織轉(zhuǎn)錄因子核因子-kappa B活化被明顯抑制，IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)明顯減少。這些結(jié)果說(shuō)明，中性粒細(xì)胞在腹腔或靜脈注射LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)和急性肺損傷的啟動(dòng)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Pae預(yù)處理能明顯減少LPS攻擊小鼠肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，表明抑制中性粒細(xì)胞向肺組織浸潤(rùn)可能是Pae防止內(nèi)毒素性ALI的機(jī)制之一。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Pae防止內(nèi)毒素性ALI的上述機(jī)制，我們采用Western blotting檢測(cè)肺組織中MPO的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射LPS明顯增加了小鼠肺組織MPO水平，Pae預(yù)處理可顯著降低LPS處理小鼠肺組織中MPO含量。MPO是一種高表達(dá)于中性粒細(xì)胞的蛋白酶，是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的主要標(biāo)記物［15］。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)抑制中性粒細(xì)胞向肺組織浸潤(rùn)是Pae防止內(nèi)毒素性ALI的重要機(jī)制。新近有研究表明，MPO缺乏可減輕 LPS誘導(dǎo)的肺損傷［15］，我們研究發(fā)現(xiàn)，Pae能減少LPS處理小鼠肺組織中MPO的含量，提示減少肺組織中MPO的水平也可能參與了Pae防止內(nèi)毒素性ALI的機(jī)制。然而，Pae通過(guò)何種機(jī)制減少LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞向肺組織浸潤(rùn)，尚需進(jìn)一步研究。Calkins等［16］研究發(fā)現(xiàn)，TNF受體p55基因敲除小鼠受到腹腔注射LPS攻擊后，肺組織趨化因子的產(chǎn)生和中心粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯低于野生型小鼠，說(shuō)明TNF介導(dǎo)了腹腔注射LPS誘導(dǎo)的肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)Pae可抑制 LPS誘導(dǎo) TNF的產(chǎn)生［8］。因此，Pae可能通過(guò)抑制TNF的表達(dá)減少LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞向肺組織浸潤(rùn)。

另一方面，Nagase 等［13］研究證實(shí)，cPLA2是內(nèi)毒素血癥誘導(dǎo)ALI的關(guān)鍵介質(zhì)，抑制cPLA2的活化能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的ALI。cPLA2催化中心連接區(qū)域的Ser505位點(diǎn)被磷酸化后激活，形成具有酶催化活性的cPLA2(phospho-cPLA2)，phospho-cPLA2通過(guò)催化細(xì)胞膜磷脂產(chǎn)生花生四烯酸 (araehidonieaeid，AA)和血小板活化因子，參與LPS誘導(dǎo)的ALI［13，17，18］。為了進(jìn)一步闡明 Pae 減輕 LPS 性 ALI的作用機(jī)制，我們采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)肺組織中phospho-cPLA2(Ser505)的表達(dá)。結(jié)果表明，內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織中磷酸化cPLA2水平顯著增高，芍藥苷可顯著降低內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織cPLA2的磷酸化。這些結(jié)果提示，Pae預(yù)防內(nèi)毒素性肺損傷的機(jī)制與其抑制cPLA2的磷酸化有關(guān)。

綜上所述，Pae能明顯減輕腹腔注射LPS誘導(dǎo)的ALI，其作用機(jī)制與減少肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、MPO含量及抑制cPLA2活化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Pae能抑制LPS攻擊小鼠肺組織中cPLA2的活化，從一個(gè)新的角度闡明了Pae防治LPS性急性肺損傷的作用機(jī)制，為Pae用于膿毒癥性肺損傷的治療提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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