• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大鼠肝臟缺血再灌注損傷后水通道蛋白4表達(dá)的變化

    2011-08-02 07:38:46燕少偉王立明張日新王海波
    中國病理生理雜志 2011年10期
    關(guān)鍵詞:滲透壓膽汁切片

    燕少偉, 王立明, 張日新, 王海波

    (1包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古 包頭 014010;2大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,遼寧 大連 116000)

    缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI),是指發(fā)生缺血的組織器官,當(dāng)恢復(fù)血液灌注后缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。肝臟作為高灌注器官,非常容易發(fā)生IRI,IRI是造成肝移植術(shù)后移植肝臟原發(fā)失功、移植失敗及慢性排斥反應(yīng)的主要原因之一,其發(fā)生率可高達(dá)88%[1]。因此,肝缺血再灌注損傷時的病理生理變化一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。

    水通道蛋白(aquaporins,AQP)是90年代新近發(fā)現(xiàn)的屬于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)蛋白中的一個家族,擁有13(AQP0-12)個成員,可以提供液體快速跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)的通路,同時也參與甘油等小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[2,3]。AQP介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)具有速度快、不受膜脂質(zhì)流動性及溫度的影響等特點(diǎn),因此推測AQP可能參與體液容量調(diào)節(jié),但其具體的生理作用還不十分清楚。雖然有許多學(xué)者對AQP家族已進(jìn)行了一些研究,但多在生理?xiàng)l件下,對在病理?xiàng)l件下如肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷時AQP變化的研究甚少。

    AQP所有成員之間的基因序列具有一定的同源性。AQP4的基因定位在人染色體18q11.2與q12.1之間的連接處,由4個分別編碼127、55、27、92位氨基酸的外顯子組成,并被0.8、0.3和5.2 kb的內(nèi)含子分隔開。AQP4的一級結(jié)構(gòu)同其它AQP一樣,為跨細(xì)胞膜6次的單肽鏈,其氨基和羥基末端均位于細(xì)胞內(nèi),含3個胞外環(huán)(A、C、E)和2個胞內(nèi)環(huán)(B、D)。AQP4整個分子前后兩部分在序列上相似,呈180°定位的正面對稱結(jié)構(gòu),內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其它AQP同源性最高的是位于B環(huán)與E環(huán)上的冬酰氨-脯氨酸-丙氨酸(NPA)基序,NPA基序重疊位于脂質(zhì)雙分子層之間,產(chǎn)生一個使水分子單線通過的通道,可使水分子順滲透壓梯度雙向轉(zhuǎn)運(yùn),這是AQP家族成員共有的特征性結(jié)構(gòu)。AQP4的四級結(jié)構(gòu)是由具有活性、分子量約34 kD亞單位組成的四聚體。四聚體在膜上的組裝是維持AQP的穩(wěn)定和其正常功能所必須的。AQP4有3個mRNA亞型,由N端外顯子的差異所決定。它們分別是AQP41M1、AQP41M23和AQP41M23X。AQP41M1編碼的蛋白為M1,AQP41M23和 AQP41M23X編碼的蛋白為M23。M1比M23在N端多22個氨基酸。亞型的表達(dá)存在組織和年齡的差異。AQP4 C端第276-280位的5個氨基酸對于AQP4在細(xì)胞膜上的固定起著不可替代的作用,它們突變或缺失將導(dǎo)致AQP4不能固定于細(xì)胞膜上,影響生物學(xué)效應(yīng)。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)AQP4能夠維持膽管細(xì)胞頂膜區(qū)和基側(cè)膜區(qū)之間水通透性的平衡,其主要調(diào)控基側(cè)膜水的通透性,負(fù)擔(dān)15%水的轉(zhuǎn)運(yùn)[4],調(diào)節(jié)水在基底面和側(cè)面的擴(kuò)散[4-6]。

    肝臟IRI后常發(fā)生淤膽等多種膽道并發(fā)癥,可能與IRI后膽汁的分泌變化有關(guān),但其分子機(jī)制目前尚不清楚。AQP4在肝臟內(nèi)只表達(dá)于肝內(nèi)膽管細(xì)胞,便于對其進(jìn)行單獨(dú)研究。膽汁主要由肝細(xì)胞分泌,并由膽管內(nèi)皮細(xì)胞和膽囊內(nèi)膜細(xì)胞通過吸收和排泌改變其成分,其中包括維持滲透壓的溶質(zhì),如膽鹽和谷光苷肽,形成可能造成水的被動轉(zhuǎn)運(yùn)的滲透壓梯度。在這一過程中,膽管細(xì)胞起著重要的作用,膽管細(xì)胞雖然只占肝臟細(xì)胞總數(shù)的3-5%,但產(chǎn)生的膽汁量約占總膽汁量的 40%,通過排泌 Na+、Cl-和HCO3-等離子,同樣形成滲透壓梯度。其功能改變可能導(dǎo)致一系列病理生理變化,如肝移植后膽道并發(fā)癥等。膽汁的生成與流動是靠膽鹽的主動排泌所導(dǎo)致的滲透壓梯度使水在AQP的易化作用下向膽管內(nèi)移動而實(shí)現(xiàn)的[7],因此AQP在肝臟膽汁分泌過程中起重要作用。而膽鹽通過肝腸循環(huán)重新回到肝臟,參與形成維持膽汁分泌的滲透壓梯度。

    目前多項(xiàng)研究表明缺血再灌注損傷與水通道蛋白間存在密切關(guān)系[8,9]。本研究通過將大鼠肝蒂夾閉30 min后恢復(fù)血液灌注的方法建立肝缺血再灌注模型[10],觀察一定時段AQP4在肝臟的表達(dá)變化情況,及在該病理?xiàng)l件下的表達(dá)變化與肝臟功能變化的關(guān)系,從新的角度探討肝缺血再灌注損傷的病理生理變化,并為其防治提供新的理論依據(jù)。

    材料和方法

    1 材料

    1.1 動物及分組 選用48只健康6周齡雄性Wistar大鼠,體重(235±15)g,由大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動物按窩別和體重配成對子,隨機(jī)分配到缺血再灌注組及對照組2 h、1、3、7 d組,每小組6只。

    1.2 主要試劑 多聚賴氨酸、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液、Trizol均購于北京中杉金橋公司;RTPCR試劑盒6×buffer、上樣緩沖液、DNA marker均購于大連寶生物公司;AQP4抗體購于武漢博士德公司。主要試劑的配制:10×TBE電泳緩沖液:三羥甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris]108 g,硼酸(boric acid)55 g,0.5 mol/L 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)(pH8.0)40 mL,加三蒸水(ddd-H2O)溶解至 1000 mL,用時10倍稀釋。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS):NaCl 8.0 g,KCl 0.20 g,Na2HPO4·H2O 1.56 g,KH2PO40.20 g,用 ddd-H2O 溶解并定容至1000 mL,調(diào)pH至7.2,高壓滅菌。二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate,DEPC)處理的 ddd-H2O:取1 mL DEPC加入999 mL ddd-H2O中,充分振蕩,常溫存放24 h后高壓蒸汽滅菌10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2 方法

    2.1 肝缺血再灌注損傷模型的建立 動物術(shù)前均自由進(jìn)食、水。麻醉方法:實(shí)驗(yàn)大鼠應(yīng)用10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉。缺血再灌注組建立全肝缺血30 min再灌注損傷模型。大鼠麻醉成功后腹部備皮,取仰臥位,熱墊保持體溫在(36.5±0.5)℃,應(yīng)用0.5%碘伏溶液常規(guī)消毒皮膚,鋪無菌孔巾,取腹部正中切口,上至劍突,下至恥骨上,逐層切開皮膚、腹白線及壁層腹膜,進(jìn)入腹腔后小心游離肝門,用無損傷動脈夾夾閉肝蒂,阻斷出入肝臟血流(在此過程中濕鹽水紗布覆蓋切口,減少腹腔的不顯性失水),30 min后重新恢復(fù)肝臟血液灌注。當(dāng)松開動脈夾后肝臟在2-5 min內(nèi)顏色由暗紅轉(zhuǎn)為鮮紅表明缺血再灌注損傷模型建立成功,關(guān)腹。若超過5 min肝臟顏色仍然未轉(zhuǎn)為鮮紅色則認(rèn)為肝臟有血栓形成,排除出實(shí)驗(yàn)。對照組將經(jīng)過相同的手術(shù)操作,但僅不夾閉肝蒂,30 min后關(guān)腹。實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉清醒后自由進(jìn)食、水,不給予抗生素。

    2.2 標(biāo)本采集 分別于再灌注2 h、1、3、7 d處死大鼠,留取標(biāo)本。經(jīng)腹主動脈取血6-8 mL靜置15 min后離心留取血清-26℃保存?zhèn)溆?,以行間接膽紅素(indirect bilirubin,IB)、直接膽紅素(direct bilirubin,DB)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)檢測。取血后迅速以4℃的PBS液10 mL經(jīng)門靜脈灌注至肝臟,摘除大鼠肝臟,每例標(biāo)本平分為兩份,一份用10%PBS甲醛液固定以行病理及免疫組化檢測,另一份于液氮冷凍1 h后轉(zhuǎn)入-80℃保存以行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptasepolymerase chain reaction,RT-PCR)檢測。每只大鼠相應(yīng)檢測標(biāo)本取材部位保持一致。

    2.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測 (1)血清IB、DB及ALT的檢測:用Olympus AU2000全自動生化分析儀檢測。(2)肝組織病理學(xué)檢測:經(jīng)10%PBS甲醛溶液固定的肝組織標(biāo)本行石蠟包埋,切片厚度為5 μm。經(jīng)梯度乙醇脫水及二甲苯置換后行HE染色,觀察組織形態(tài)學(xué)變化。(3)AQP4的免疫組化檢測:肝臟蠟塊標(biāo)本切片厚度為5 μm,經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇處理至水后,滴加0.3%過氧化氫室溫(溫度20℃,濕度80%)孵育10 min,以除去內(nèi)源性過氧化物酶,PBS水洗3 min×3次;在0.1 mol/L枸櫞酸鈉液中高壓鍋(2 atm)抗原修復(fù)10 min,室溫自然冷卻后PBS洗3 min×3次;正常非免疫動物血清封閉10 min;滴加AQP4Ⅰ抗(兔抗鼠多克隆抗體,PBS稀釋 AQP41∶100)4℃孵育過夜,PBS洗3 min×3次;滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗(羊抗兔IgG抗體)室溫孵育15 min,PBS洗3 min×3次;滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶室溫孵育15 min,PBS洗3 min×3次后行DAB顯色1 min。在10×10倍光鏡下以每張切片胞膜上呈清晰黃褐色顆粒表達(dá)為陽性表達(dá)。隨機(jī)選取互不重疊的視野5個,10×40倍視野下對陽性表達(dá)區(qū)域,經(jīng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描,檢測每個視野內(nèi)平均吸光度值,進(jìn)行統(tǒng)計分析。(4)RT-PCR檢測肝組織AQP4 mRNA的表達(dá):應(yīng)用Trizol試劑常規(guī)一步法提取肝組織標(biāo)本總RNA。以隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:取2 μL RNA加入隨機(jī)引物1 μL 70℃水浴5 min,冰水驟冷,隨后加入5×PCR緩沖液4 μL,20 mmol/L dNTP 1 μL,RNasin 0.4 μL,蒸餾水3.4 μL,M - MLV 0.2 μL,總反應(yīng)體積為 20 μL;反應(yīng)條件:37℃ 60 min,90℃ 5 min。引物序列為:上游引物5'-GCATGAATCCAGCTCGATCCTTTGG -3',下游引物5'-AATGGGTGGCAGGAAATCTGAGGC -3',擴(kuò)增片段長度407 bp。β-actin引物序列為:上游引物5’- GATATCGCTGCGCTCGTCGTC -3',下游引物5’- CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC -3’,擴(kuò)增片段長度560 bp。PCR反應(yīng)體系為:1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,10 ×PCR 緩沖液2 μL,20 mmol/L dNTP 1 μL,Taq 酶0.1 μL,引物1 μL,余量以蒸餾水補(bǔ)足體積至20 μL,PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:95℃ 1.5 min,55℃ 2 min,72℃ 1 min,40個循環(huán),最后72℃ 8 min。反應(yīng)產(chǎn)物10 μL加于1%瓊脂糖凝膠中電泳20 min,取出凝膠,紫外度值,以目標(biāo)條帶灰度和β-actin灰度的比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    配對樣本在透視分光儀下觀察結(jié)果并攝片,用β-actin校正半定量,凝膠圖像分析系統(tǒng)測定各電泳帶灰度值兩兩比較采用配對t檢驗(yàn)。均采用 SPSS for Windows 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

    結(jié) 果

    1 模型建立情況

    所有實(shí)驗(yàn)大鼠除2 h處死組外均于術(shù)后4 h內(nèi)清醒,自由進(jìn)食、水。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均無腹腔感染,無死亡發(fā)生。

    2 肝功能檢測

    各對照組間血清DB差異無顯著(P>0.05),缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術(shù)后血清DB較對照組明顯升高(P<0.05),術(shù)后第1 d最高[(11.80±1.07)μmol/L缺血再灌注組 vs(5.01±0.53)μmol/L對照組],P<0.05,以后逐漸減少,于術(shù)后第7 d恢復(fù)正常[(5.53±0.41)μmol/L缺血再灌注組 vs(5.13±0.27)μmol/L對照組]。各對照組間血清IB差異無顯著(P>0.05),缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術(shù)后血清IB較對照組明顯升高(P<0.05),術(shù)后第1 d最高[(20.71±1.46)μmol/L缺血再灌注組vs(7.62±0.98)μmol/L對照組],以后逐漸減少,于術(shù)后第7 d恢復(fù)正常[(7.86±1.23)μmol/L缺血再灌注組 vs(6.53±0.87)μmol/L對照組]。各對照組間血清ALT差異無顯著(P>0.05),缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術(shù)后血清ALT較對照組明顯升高(P<0.05),術(shù)后第1d最高[(55.75±3.31)U/L缺血再灌注組 vs(33.46±2.06)U/L對照組],以后逐漸減少,于術(shù)后第 7d恢復(fù)正常[(22.32±1.16)U/L缺血再灌注組 vs(21.09±1.13)U/L對照組],見圖1-3。

    Figure 1.Comparison of serum DB level in rats 2 h,1 d,3 d and 7 d after hepatic ischemia-reperfusion injury..n=6.*P <0.05 vs sham -operation group.圖1 缺血再灌注組與對照組大鼠血清DB濃度比較

    Figure 2.Comparison of serum IB level in rats 2 h,1 d,3 d and 7 d after hepatic ischemia-reperfusion injury..n=6.*P <0.05 vs sham -operation group.圖2 缺血再灌注組與對照組大鼠血IB濃度比較

    3 肝臟病理學(xué)檢測

    通過對肝臟組織切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組肝臟小葉中央靜脈周圍可見點(diǎn)片狀壞死區(qū)域,見圖4A、B。

    4 免疫組化染色結(jié)果

    在對照2 h、第1 d、第3 d、第7 d組均可見肝內(nèi)膽管細(xì)胞AQP4表達(dá)陽性(A值分別為4033±316、4136±505、3929±328、3892±277),各對照組間差異無顯著(P>0.05);在 IRI各時相組,可見IRI后2 h、第1 d、第3 d AQP4表達(dá)均較對照組顯著下降(A值分別為2836±255、1279±107、2296±217),與對照組比較均顯著差異(P<0.05),見圖5-9。其中以術(shù)后第1 d變化最顯著,以后AQP4的表達(dá)量逐漸增多,到術(shù)后第7 d時IRI組A值與對照組比較,差異無顯著(P>0.05),見圖10。

    5 RT-PCR結(jié)果

    對照組各時點(diǎn)AQP4 mRNA表達(dá)差異無顯著(P>0.05)。在 IRI各時相組,可見在 IRI后2 h、1 d、3 d AQP4 mRNA表達(dá)較對照組顯著下降(P<0.05),IRI后第1 d組AQP4 mRNA表達(dá)下降最明顯,以后逐漸增加,IRI第7 d AQP4 mRNA表達(dá)恢復(fù)正常,見圖11、12。

    Figure 3.Comparison of serum ALT activity in rats 2 h,1 d,3 d and 7 d after hepatic ischemia-reperfusion injury..n=6.*P <0.05 vs sham -operation group.圖3 缺血再灌注組與對照組大鼠血ALT活性比較

    Figure 4.Pathological changes of rat liver tissues(HE staining,×100).A:ischemia - reperfusion 1 d group.Arrows indicate the degeneration and necrosis of cells.B:sham-operation group.圖4 缺血再灌注組和對照組大鼠肝組織HE染色切片

    Figure 5.Immunohistochemical staining of AQP4 in rat liver section(×100)from sham -operation group.Cholangiocytes were stained as arrows indicated.圖5 對照組大鼠肝組織切片AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

    Figure 6.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia-reperfusion 2 h group.Cholangiocyte staining(arrow -indicated)was obviously reduced.圖6 缺血再灌注2 h組AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

    Figure 7.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia-reperfusion 1 d group.Arrow-indicated cholangiocyte staining was the weakest.圖7 缺血再灌注1 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

    Figure 8.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia-reperfusion 3 d group.Arrow -indicated cholangiocyte staining restored a little.圖8 缺血再灌注3 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

    Figure 9.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia-reperfusion 7 d group.Cholangiocyte staining obviously restored(arrow-indicated).圖9 缺血再灌注7 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

    Figure 10.Comparison of AQP4 expression in liver tissues examined using immunohistochemical staining in rats 2 h,1 d,3 d and 7 d after hepatic ischemia - reperfusion injury..n=6.*P<0.05 vs sham-operation group.圖10 AQP4免疫組化染色強(qiáng)度比較

    Figure 11.Comparison of AQP4 mRNA expression examined by RT - PCR in the liver of rats 2 h,1 d,3 d and 7 d after hepatic ischemia-reperfusion injury..n=6.*P <0.05 vs sham -operation group.圖11 AQP4 mRNA相對表達(dá)水平比較

    Figure 12.Electrophoresis results of RT-PCR product of AQP4 mRNA in ischemia - reperfusion 2 h,1,3,7 d groups(A)and sham -operation group(B).圖12 缺血再灌注組和對照組AQP4 mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

    討 論

    1 肝臟缺血再灌注模型問題

    目前大鼠肝臟缺血再灌注模型建模方法較多,以夾閉肝蒂30 min和夾閉肝蒂及肝下下腔靜脈20 min的全肝缺血再灌注模型最為普遍,前者具有操作相對簡單及模型大鼠成活率高的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過將模型大鼠肝蒂夾閉30 min后重新使其開放的方法建立肝臟缺血再灌注模型,在大體觀察上可見夾閉肝蒂后肝臟顏色明顯由鮮紅色轉(zhuǎn)為暗紅色,重新開放后又轉(zhuǎn)為鮮紅色;術(shù)后模型組大鼠出現(xiàn)血轉(zhuǎn)胺酶、膽紅素升高等肝功能受損表現(xiàn);肝組織病理切片可見模型組大鼠肝細(xì)胞點(diǎn)片狀變性、壞死。這些變化與國內(nèi)外關(guān)于缺血再灌注時肝臟的病理生理改變的報道相似,故本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的動物模型準(zhǔn)確可靠。缺血再灌注組大鼠雖在夾閉肝蒂時同時夾閉了膽總管,但結(jié)扎膽總管8-24 h后方可造成膽紅素升高[11],同時經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明單純結(jié)扎膽總管30 min與對照組比較,膽紅素變化無顯著差異(P>0.05),故本實(shí)驗(yàn)中IRI組大鼠術(shù)后膽紅素升高不是由膽道阻斷所致。

    2 AQP4在肝臟的定位表達(dá)與IRI

    大鼠肝細(xì)胞(hepatocytes)主要表達(dá)AQP0、AQP8和 AQP9[12-14],大鼠肝內(nèi)膽管細(xì)胞(cholangiocytes)所表達(dá)的AQP種類是目前已知的所有細(xì)胞中最多的:AQP0、AQP1、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9和AQP11[15],其中 AQP1和 AQP4 研究較為深入,包括分子、生化和功能研究。AQP4在肝臟主要存在于肝內(nèi)膽管細(xì)胞基底面和側(cè)面,在這個區(qū)域有高表達(dá)。AQP4只表達(dá)于肝內(nèi)膽管細(xì)胞而在肝細(xì)胞無表達(dá),便于對其進(jìn)行單獨(dú)研究。研究表明,鼠肝內(nèi)膽管細(xì)胞AQP4過度表達(dá)導(dǎo)致對水的通透性升高。膽汁中98%為水,膽汁分泌與AQP密切相關(guān)[16]。蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)可通過蛋白磷酸化的方式調(diào)節(jié)AQP4活性。PKC可在轉(zhuǎn)錄水平對AQP4 mRNA進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH值也是影響AQP家族表達(dá)的因素,尤其是當(dāng)pH降到5.5以后,AQP4對乳酸鹽和水表現(xiàn)出特殊的通透性,其他如多巴胺、碳酸酐酶抑制劑及高水平的血小板源生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等也影響著AQP4的分布與表達(dá)。AQP4基因啟動子區(qū)域有一低氧誘導(dǎo)因子結(jié)合基序。低氧可下調(diào)AQP4 mRNA及蛋白的表達(dá),重新給氧又可使AQP4水平恢復(fù)。溫度、激素、生長因子、視黃酸等因素的變化都會對水通道產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測方法發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管可見棕黃色濃染,證明AQP4表達(dá)在肝內(nèi)膽管細(xì)胞,這與國內(nèi)外其它相關(guān)文獻(xiàn)報道相符。

    肝臟是人體最大的消化腺,每天產(chǎn)生800-1000 mL膽汁,因此人們一直關(guān)注AQP在肝臟的分布、表達(dá)和功能。膽汁的生成與流動是靠膽鹽的主動排泌所造成的滲透壓梯度使水在AQP的易化作用下向膽管內(nèi)移動實(shí)現(xiàn)的,而膽鹽通過肝腸循環(huán)重新回到肝臟,參與形成維持膽汁分泌的滲透壓梯度。AQP可以在存在滲透壓的情況下加速水的轉(zhuǎn)運(yùn),肝內(nèi)膽管管腔和膽管上皮細(xì)胞基底的滲透壓差是持續(xù)存在的,發(fā)生肝內(nèi)膽汁淤積時此滲透壓差可能會更高,此時水的通透量是決定膽汁生成量的主要因素,而水的通透量則取決于AQP的表達(dá)量及功能,本實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷時,AQP4表達(dá)下降,可以解釋肝內(nèi)膽管細(xì)胞水通透性降低及肝內(nèi)膽汁淤積。當(dāng)肝臟發(fā)生局部缺血時,缺血的肝組織進(jìn)行無氧代謝使ATP生成減少,肝內(nèi)膽管細(xì)胞中AQP4的數(shù)量和功能可能隨之改變,使水順滲透壓梯度向膽管內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)減少。而通過肝腸循環(huán)的膽鹽排泌保持較為恒定的數(shù)量(與腸道吸收的數(shù)量保持平衡),造成肝小管內(nèi)膽汁濃度過高,致使功能性淤膽。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝IRI后AQP4及AQP4 mRNA的表達(dá)量較對照組明顯減少,伴隨AQP4表達(dá)減少,大鼠血膽紅素迅速升高;隨著AQP4表達(dá)量的恢復(fù),大鼠血膽紅素也漸趨正常,AQP4表達(dá)的減少可能是導(dǎo)致IRI后功能性淤膽的重要原因。

    [1]Ploeg RJ,D'Alessandro AM,Knechtle SJ,et al.Risk factors for primary dysfunction after liver transplantation-A multivariate analysis[J].Transplantation,1993,55(4):807-813.

    [2]Pribush A,Meyerstein D,Meyerstein N,et al.Kinetics of erythrocyte swelling and membrane hole formation in hypotonic midia[J].Biochim Biophys Acta,2002,1558(2):119-132.

    [3]Wolburg H,Wolburg-Buchholz K,F(xiàn)allier-Becker P,et al.Structure and functions of aquaporin-4-based orthogonal arrays of particles[J].Int Rev Cell Mol Biol,2011,287:1 -41.

    [4]Marinelli RA,Pham LD,Tietz PS,et al.Expression of aquaporin - 4 water channels in rat cholangiocytes[J].Hepatology,2000,31(6):1313 -1317.

    [5]Splinter PL,Masyuk AI,LaRusso NF,et al.Specific inhibition of AQP1 water channels in isolated rat intrahepatic bile duct units by small interfering RNAs[J].J Biol Chem,2003,278(8):6268 -6274.

    [6]Splinter PL,Masyuk AI,Marinelli RA,et al.AQP4 transfected into mouse cholangiocytes promotes water transport in biliary epithelia[J].Hepatology,2004,39(1):109-116.

    [7]Calamita G,F(xiàn)erri D,Gena P,et al.Water transport into bile and role in bile formation[J].Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord,2005,5(2):137 -142.

    [8]鄭躍英,蘭允平,祝勝美.大鼠腦缺血/再灌注損傷后梗死灶周圍水通道蛋白4與血腦屏障通透性的動態(tài)變化[J].中國病理生理雜志,2008,24(8):1647-1649,1655.

    [9]馬紅婷,王 濤,李 震.神經(jīng)調(diào)節(jié)素治療小鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制[J].中國病理生理雜志,2009,25(3):460- 466.

    [10]Mota-Filipe H,Sepodes B,McDonald MC,et al.The novel PARP inhibitor 5-aminoisoquinolinone reduces the liver injury caused by ischemia and reperfusion in the rat[J].Med Sci Monit,2002,8(11):BR444 - BR453.

    [11]Park PH,Nan JX,Park EJ,et al.Effect of tetrandrine on experimental hepatic fibrosis induced by bile duct ligation and scission in rats[J].Pharmacol Toxicol,2000,87(6):261-268.

    [12]Tietz P,Jefferson J,Pagano R,et al.Membrane microdomains in hepatocytes:potential target areas for proteins involved in canalicular bile secretion[J].Lipid Res,2005,46(7):1426 -1432.

    [13]Rama-Rao KV,Chen M,Simard JM,et al.Increased aquaporin-4 expression in ammonia-treated cultured astrocytes[J].Neuroreport,2003,14(18):2379 - 2382.

    [14]Talbot NC,Garrett WM,Caperna TJ,et al.Analysis of the expression of aquaporin-1 and aquaporin-9 in pig liver tissue:comparison with rat liver tissue[J].Cells Tissues Organs,2003,174(3):117 -128.

    [15]Masyuk AI,Marinelli RA,LaRusso NF,et al.Water transport by epithelia of the digestive tract[J].Gastroenterology,2002,122(2):545 -562.

    [16]Gong AY,Masyuk AI,Splinter PL,et al.Channel-mediated water movement across enclosed or perfused mouse intrahepatic bile duct units[J].Am J Physiol Cell Physiol,2002,283(1):C338 - C346.

    猜你喜歡
    滲透壓膽汁切片
    高考生物問答復(fù)習(xí)之滲透壓
    妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥
    肝博士(2020年5期)2021-01-18 02:50:28
    化基本概念為源頭活水
    ——2017年滲透壓相關(guān)高考真題賞析
    基于SDN與NFV的網(wǎng)絡(luò)切片架構(gòu)
    超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺置管引流術(shù)在膽汁瘤治療中的應(yīng)用
    腎穿刺組織冷凍切片技術(shù)的改進(jìn)方法
    心搏驟停后綜合征患者血漿滲透壓測定的臨床意義
    冰凍切片、快速石蠟切片在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷中的應(yīng)用價值比較
    膽汁淤積性肝病問題解答
    肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:51
    蜂蜜中耐高滲透壓酵母菌的分離與鑒定
    女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 五月玫瑰六月丁香| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久精品免费免费高清| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 性色avwww在线观看| 国产精品免费大片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 麻豆成人av视频| 亚洲av综合色区一区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人黄色视频免费在线看| av天堂中文字幕网| 涩涩av久久男人的天堂| 水蜜桃什么品种好| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲人成网站高清观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 少妇高潮的动态图| 亚洲不卡免费看| 高清不卡的av网站| 精品人妻视频免费看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| av女优亚洲男人天堂| 精品一区二区免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文天堂在线官网| 亚洲av二区三区四区| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久精品免费免费高清| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99久久人妻综合| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美3d第一页| a级毛色黄片| 成年人午夜在线观看视频| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产视频首页在线观看| 色吧在线观看| xxx大片免费视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 99视频精品全部免费 在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 高清不卡的av网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 99九九线精品视频在线观看视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美xxⅹ黑人| 黄色一级大片看看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产91av在线免费观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩大片免费观看网站| 男女边摸边吃奶| 少妇高潮的动态图| 亚洲国产日韩一区二区| 国产在线男女| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品久久久久久电影网| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 伦理电影大哥的女人| 成年免费大片在线观看| 欧美zozozo另类| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在线观看一区二区三区激情| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久鲁丝午夜福利片| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 狂野欧美激情性bbbbbb| 深爱激情五月婷婷| 久久国产乱子免费精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲成人一二三区av| 一本久久精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 18+在线观看网站| 如何舔出高潮| 亚洲四区av| 久久久精品94久久精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜免费男女啪啪视频观看| 另类亚洲欧美激情| 欧美高清成人免费视频www| 成人午夜精彩视频在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 在线观看免费高清a一片| 国产成人精品婷婷| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产一区二区在线观看日韩| 寂寞人妻少妇视频99o| 成人亚洲欧美一区二区av| 老司机影院毛片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 91久久精品电影网| 免费高清在线观看视频在线观看| 免费观看av网站的网址| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美人与善性xxx| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲久久久国产精品| 一个人免费看片子| 国产日韩欧美在线精品| 日韩电影二区| h视频一区二区三区| 久热这里只有精品99| 熟女av电影| 国产在线视频一区二区| 亚洲最大成人中文| 国产精品熟女久久久久浪| 99久久精品热视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日本色播在线视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品人妻视频免费看| 永久免费av网站大全| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜日本视频在线| av国产免费在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av免费观看日本| 亚洲伊人久久精品综合| 午夜激情久久久久久久| 欧美精品国产亚洲| 麻豆国产97在线/欧美| 久久久久久久精品精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 春色校园在线视频观看| 一区二区三区乱码不卡18| 国产淫片久久久久久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 九九爱精品视频在线观看| 久久久久网色| 欧美少妇被猛烈插入视频| 97在线视频观看| 欧美另类一区| 亚洲国产欧美人成| av免费在线看不卡| 免费av中文字幕在线| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产免费一区二区三区四区乱码| 三级国产精品片| 99热全是精品| 成人二区视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品亚洲成a人片在线观看 | 精品一区二区三卡| 91精品一卡2卡3卡4卡| 大香蕉久久网| 久久鲁丝午夜福利片| 人体艺术视频欧美日本| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲国产日韩一区二区| 欧美最新免费一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 少妇人妻 视频| 欧美bdsm另类| 最黄视频免费看| 日韩中字成人| 22中文网久久字幕| 国产黄色免费在线视频| 国产一区二区三区av在线| 亚洲av中文av极速乱| 欧美区成人在线视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 三级经典国产精品| 秋霞伦理黄片| av黄色大香蕉| av线在线观看网站| 99热全是精品| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲综合色惰| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产永久视频网站| 22中文网久久字幕| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩伦理黄色片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲av男天堂| 欧美精品国产亚洲| www.色视频.com| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲天堂av无毛| 99九九线精品视频在线观看视频| 一本一本综合久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 在线观看一区二区三区激情| 精品酒店卫生间| 国产一区二区三区av在线| 少妇的逼好多水| 日韩亚洲欧美综合| 精品亚洲成a人片在线观看 | 日本色播在线视频| 多毛熟女@视频| 91精品国产国语对白视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美区成人在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 日韩欧美精品免费久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲精品456在线播放app| 在线免费观看不下载黄p国产| 99久国产av精品国产电影| av在线播放精品| 美女内射精品一级片tv| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲色图综合在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 最黄视频免费看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜免费鲁丝| 好男人视频免费观看在线| 亚洲综合精品二区| 麻豆乱淫一区二区| 丝袜喷水一区| 国产探花极品一区二区| 在线播放无遮挡| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 韩国av在线不卡| 亚洲精品日本国产第一区| 大香蕉97超碰在线| 好男人视频免费观看在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产av国产精品国产| 色视频在线一区二区三区| 一级二级三级毛片免费看| 激情五月婷婷亚洲| 国产男女内射视频| 我的女老师完整版在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| av国产免费在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲欧美成人精品一区二区| 又爽又黄a免费视频| 久久久久久久国产电影| 久热这里只有精品99| 国产成人freesex在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲熟女精品中文字幕| 搡老乐熟女国产| 少妇 在线观看| av在线老鸭窝| 色综合色国产| 亚洲精品,欧美精品| 在线观看国产h片| 最后的刺客免费高清国语| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美成人精品欧美一级黄| 伦理电影大哥的女人| 免费观看a级毛片全部| 久久久国产一区二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 麻豆成人av视频| www.色视频.com| 亚洲四区av| 国产 一区 欧美 日韩| 日本免费在线观看一区| 亚洲国产精品专区欧美| 天美传媒精品一区二区| 国产视频内射| 国产免费又黄又爽又色| 插逼视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品久久国产蜜桃| 能在线免费看毛片的网站| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人亚洲精品一区在线观看 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 老女人水多毛片| 国产有黄有色有爽视频| 一区二区av电影网| 亚洲成人手机| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲av男天堂| 一区二区三区免费毛片| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av二区三区四区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 97精品久久久久久久久久精品| 国产精品伦人一区二区| 国产在线免费精品| 在线观看av片永久免费下载| av免费在线看不卡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日本黄色片子视频| kizo精华| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲av日韩在线播放| 国产成人精品久久久久久| 国产精品久久久久久久电影| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 身体一侧抽搐| 国产极品天堂在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产男女内射视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 中国国产av一级| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 免费观看性生交大片5| 天美传媒精品一区二区| 插阴视频在线观看视频| 热re99久久精品国产66热6| 另类亚洲欧美激情| 男人舔奶头视频| 成人特级av手机在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 熟女av电影| 久久国产乱子免费精品| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 一级黄片播放器| 国产又色又爽无遮挡免| 三级国产精品欧美在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 男男h啪啪无遮挡| 国产淫语在线视频| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 在线看a的网站| 久久ye,这里只有精品| 美女视频免费永久观看网站| 欧美最新免费一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品一区www在线观看| av视频免费观看在线观看| 日本色播在线视频| 免费观看的影片在线观看| 99热这里只有是精品50| 亚洲欧美精品自产自拍| 在线观看三级黄色| 乱系列少妇在线播放| 日韩电影二区| 婷婷色麻豆天堂久久| 偷拍熟女少妇极品色| 人妻系列 视频| 高清视频免费观看一区二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 国产精品久久久久久精品电影小说 | av福利片在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 观看免费一级毛片| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美一区二区亚洲| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 看免费成人av毛片| 久久久午夜欧美精品| 青青草视频在线视频观看| 欧美高清性xxxxhd video| 老司机影院毛片| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品国产成人久久av| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲无线观看免费| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲欧美清纯卡通| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产在线视频一区二区| 国产黄频视频在线观看| 免费观看性生交大片5| 中文字幕亚洲精品专区| 国产男女超爽视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 久久人人爽人人片av| 亚洲,欧美,日韩| 精品国产乱码久久久久久小说| 卡戴珊不雅视频在线播放| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲av.av天堂| 人妻少妇偷人精品九色| 黑丝袜美女国产一区| 色哟哟·www| 国产亚洲一区二区精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一区二区三区免费毛片| 熟女av电影| 国产成人精品婷婷| 国产精品蜜桃在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 18禁在线播放成人免费| 高清在线视频一区二区三区| 制服丝袜香蕉在线| 97在线视频观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品酒店卫生间| 亚州av有码| 日韩一区二区三区影片| 久久久久久久久久成人| 一区二区av电影网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美国产精品一级二级三级 | 99热全是精品| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲综合色惰| 中文字幕免费在线视频6| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 免费看光身美女| 最近最新中文字幕免费大全7| 美女高潮的动态| 黑丝袜美女国产一区| 在线观看国产h片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品99久久99久久久不卡 | av国产精品久久久久影院| 春色校园在线视频观看| 国产在线一区二区三区精| 边亲边吃奶的免费视频| 国产av国产精品国产| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久久伊人网av| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产日韩欧美在线精品| av网站免费在线观看视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 成年女人在线观看亚洲视频| 美女国产视频在线观看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲最大成人中文| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 免费黄色在线免费观看| av天堂中文字幕网| 一区二区三区四区激情视频| 免费看不卡的av| 99久久中文字幕三级久久日本| 国内精品宾馆在线| 伦精品一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 中文字幕制服av| 亚洲精品视频女| 99久国产av精品国产电影| 亚洲中文av在线| 激情 狠狠 欧美| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩中字成人| 国产精品国产三级国产专区5o| av网站免费在线观看视频| 久久午夜福利片| 亚洲久久久国产精品| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲人成网站在线播| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产精品熟女久久久久浪| 国产欧美亚洲国产| 91久久精品国产一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品视频女| 能在线免费看毛片的网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩制服骚丝袜av| 韩国av在线不卡| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 少妇高潮的动态图| 色哟哟·www| 18禁动态无遮挡网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲色图综合在线观看| 成人综合一区亚洲| 看非洲黑人一级黄片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 91精品一卡2卡3卡4卡| 中国国产av一级| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 在线观看三级黄色| 国产色爽女视频免费观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 一区二区三区免费毛片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 各种免费的搞黄视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品成人在线| 少妇熟女欧美另类| 22中文网久久字幕| 日本欧美国产在线视频| 大香蕉久久网| 色视频在线一区二区三区| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品一及| 国产91av在线免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成人无遮挡网站| 日韩成人伦理影院| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成年av动漫网址| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美丝袜亚洲另类| 免费观看av网站的网址| 青青草视频在线视频观看| 男人添女人高潮全过程视频| 美女国产视频在线观看| 国产一级毛片在线| 久久精品人妻少妇| 国产淫片久久久久久久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 天美传媒精品一区二区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级a做视频免费观看| 91精品国产九色| 午夜福利在线在线| av女优亚洲男人天堂| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产免费视频播放在线视频| kizo精华| 精品久久久久久久久av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 在线观看一区二区三区| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美精品一区二区大全| 乱系列少妇在线播放| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美精品一区二区大全| 男人和女人高潮做爰伦理| 波野结衣二区三区在线| 天堂8中文在线网| 久久久久久久亚洲中文字幕| 97超视频在线观看视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 久久人人爽人人片av| 亚洲av中文av极速乱| 国产乱来视频区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费观看的影片在线观看| 全区人妻精品视频| 美女内射精品一级片tv| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久久久精品精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 搡老乐熟女国产| 日韩电影二区| 日韩中文字幕视频在线看片 | 多毛熟女@视频| 老女人水多毛片| 亚洲美女视频黄频| 一级av片app| 久久精品国产自在天天线| 国产精品蜜桃在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩av在线免费看完整版不卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久久午夜欧美精品| 久久99热6这里只有精品| av国产免费在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲美女搞黄在线观看| 色吧在线观看| 久久婷婷青草| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲最大成人中文| 91精品国产国语对白视频| 国产男女超爽视频在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 国产免费福利视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 妹子高潮喷水视频|