國(guó)產(chǎn)氨酚氫可酮片人體生物等效性研究

郝光濤，馬 蒙，曲恒燕，李媛媛，劉偉麗，張麗娟，劉澤源（.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院藥理室，北京 0007；.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 33030）

氨酚氫可酮片是活性成分為對(duì)乙酰氨基酚及重酒石酸氫可酮的復(fù)方制劑。對(duì)乙酰氨基酚是乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛藥，通過抑制前列腺素的合成阻斷痛覺末梢神經(jīng)的傳遞，重酒石酸氫可酮是一種半合成的阿片類鎮(zhèn)痛止咳藥，主要作用于中樞阿片受體，不會(huì)逆轉(zhuǎn)或拮抗同時(shí)應(yīng)用的其他激動(dòng)劑的作用；二者合用能同時(shí)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮協(xié)同止痛作用，使兩種成分的鎮(zhèn)痛作用相加，而副作用不相加，臨床應(yīng)用廣泛[1-4]。本試驗(yàn)采用高效液湘-質(zhì)譜-質(zhì)譜（HPLC-MS-MS）法測(cè)定服用氨酚氫可酮片后人血漿中對(duì)乙酰氨基酚和重酒石酸氫可酮的濃度，并對(duì)受試制劑的藥動(dòng)學(xué)特性、生物利用度及其與參比制劑的生物等效性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津），其中，高效液相色譜系統(tǒng)包括二元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，串聯(lián)質(zhì)譜儀為API 3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，含電噴霧離子化源以及串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器；色譜工作站：Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)AB公司）。GL-88B旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；AB104電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；SIGMA 2K-15型高速低溫離心機(jī)（美國(guó)SIGMA公司）；Milli-Q Plus純水器（美國(guó)密理博中國(guó)有限公司）。

1.2 藥品

受試制劑：氨酚氫可酮片（國(guó)藥集團(tuán)工業(yè)有限公司，規(guī)格：每片含重酒石酸氫可酮5 mg，對(duì)乙酰氨基酚500 mg，批號(hào)100406）；參比制劑：氨酚氫可酮片（美國(guó)華生制藥股份有限公司，規(guī)格：每片含重酒石酸氫可酮5 mg，對(duì)乙酰氨基酚500 mg，批號(hào)211088B）。

對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：99.3%，批號(hào)100018-200408）；內(nèi)標(biāo)：地西泮（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：99.0%，批號(hào)1230-9601）；重酒石酸氫可酮標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：99.7%，批號(hào)171262-200701）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，空白人血漿由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院血液科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 研究對(duì)象

24名健康男性志愿者，平均年齡（32.13±2.74）歲，平均身高（1.71±0.05） m，平均體重為（64.04±4.06） kg，體重指數(shù)（21.96±0.99），經(jīng)心電圖、胸片、血常規(guī)、血生化、尿常規(guī)及肝、腎功能等檢查均正常。受試者均無煙酒嗜好，受試前2周內(nèi)未服用過任何藥物，均自愿參加并簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

2.2 試驗(yàn)方案

本試驗(yàn)采用雙周期自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，單劑量口服給藥，全部受試者隨機(jī)進(jìn)入2個(gè)試驗(yàn)組，每組12名。每組受試者每次試驗(yàn)時(shí)分別服用受試制劑或參比制劑。兩次用藥間隔7 d。

受試者于試驗(yàn)前一天晚上20∶00前入住藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)Ⅰ期病房，22∶00開始禁食，第二天早上8∶00空腹用200 mL溫開水送服1片氨酚氫可酮片，服藥后2 h方可再飲水，4 h后統(tǒng)一進(jìn)食低脂膳食。分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16、24 h取上肢靜脈血5.0 mL，肝素抗凝血樣于常溫下靜置0.5 h后，3000 r·min-1離心10 min，上層血漿于- 20 ℃保存待測(cè)。

2.3 對(duì)乙酰氨基酚血藥濃度測(cè)定方法

2.3.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Agillent-C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%甲酸水溶液（85∶15）；柱溫：室溫；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL。

離子源：電噴霧離子化源（ESI源）；離子極性：正離子（positive）；離子檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式；噴射電壓：4000 V；離子源溫度：350℃；源內(nèi)氣體1（GS1，N2） 壓力：30 psi；源內(nèi)氣體2（GS2，N2） 壓力：60 psi；CE電壓：19 V；Fragmentor電壓：160 V；用于定量分析的離子反應(yīng)對(duì)分別為質(zhì)荷比m/z152.1→m/z110.1（對(duì)乙酰氨基酚）和m/z285.0→m/z193.0（地西泮，內(nèi)標(biāo)）。

2.3.2 血漿樣品的處理與測(cè)定 精密量取50 μL血漿樣品，置具塞玻璃試管中，依次加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液（500 μg·L-1地西泮溶液）、500 μL甲醇溶液，混合均勻，4 ℃，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣1 μL進(jìn)行LC-MS-MS分析。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿50 μL，依次加入對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL和內(nèi)標(biāo)50 μL，配制成相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚血漿濃度為0.1、0.25、1、2.5、10、16、20 mg·L-1的血漿樣品，按樣品處理與測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，以樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，對(duì)乙酰氨基酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W = 1/x2）[6]最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得回歸方程：對(duì)乙酰氨基酚Y= 0.666X+ 0.006 31，r2= 0.999 8。表明對(duì)乙酰氨基酚血藥濃度在0.1～20 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，定量下限為0.1 mg·L-1。

2.3.4 方法學(xué)考察 在空白人血漿中加入不同量的對(duì)乙酰氨基酚制成低、中、高（0.25、2.5、16 mg·L-1）不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，每個(gè)濃度各6個(gè)樣品，按上述測(cè)定方法分別測(cè)定日內(nèi)、日間變異，結(jié)果見表1。

表1 HPLC法測(cè)定血漿中對(duì)乙酰氨基酚的準(zhǔn)確度、精密度及回收率.n = 18Tab 1 Accuracy, precision and recovery of paracetamol in plasma with HPLC.n = 18

2.4 重酒石酸氫可酮血藥濃度測(cè)定方法

2.4.1 色譜和質(zhì)譜條 色譜柱：Agillent-C18柱（2.1 mm×50 mm, 3.5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%甲酸水溶液，梯度洗脫；流速：0.35 mL·min-1；梯度洗脫；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

離子源：電噴霧離子化源（ESI源）；離子極性：正離子（positive）；離子檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式；噴射電壓：4000 V；離子源溫度：350℃；源內(nèi)氣體1（GS1，N2）壓力：30 psi；源內(nèi)氣體2（GS2，N2）壓力：60 psi；CE電壓：19 V；Fragmentor電壓：160 V；用于定量分析的離子反應(yīng)對(duì)分別為質(zhì)荷比m/z 300.2→m/z 199.1（重酒石酸氫可酮）和m/z 285.0→m/z 193.0（地西泮，內(nèi)標(biāo)）。

2.4.2 血漿樣品的處理與測(cè)定 精密量取50 μL血漿樣品，置1.5 mL具塞玻璃試管中，依次加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液（5 μg·L-1地西泮甲醇溶液）、補(bǔ)加1050 μL甲醇溶液，混合均勻，4 ℃ 15 000 r·min-1離心10 min，取上清液800 μL，40 ℃水浴氮?dú)鈸]干，150 μL純水復(fù)溶，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行LC-MS-MS分析。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿50 mL，依次加入重酒石酸氫可酮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL和內(nèi)標(biāo)50 μL，配制成相當(dāng)于血漿濃度為0.5、1、2.5、10、25、40、50 μg·L-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下依法操作，制備工作曲線。以血漿中待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W = 1/x2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程：Y = 0.069 6X＋0.022 6，r = 0.997 6，定量下限為0.5 μg·L-1。

2.4.4 方法學(xué)考察 在空白人血漿中加入不同量的鹽酸羥考酮制成低、中、高（1、10、40 μg·L-1）不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣，每個(gè)濃度各6個(gè)樣品，按上述測(cè)定方法分別測(cè)定日內(nèi)、日間變異，結(jié)果見表2。

表2 LC-MS-MS測(cè)定血漿中重酒石酸氫可酮方法的準(zhǔn)確度、精密度及回收率.n = 18Tab 2 Accuracy, precision and recovery of hydrocodone bitartrate in plasma with LC-MS-MS.n = 18

2.5 血藥濃度測(cè)定結(jié)果和主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

經(jīng)3p97藥動(dòng)學(xué)程序擬合，受試制劑與參比制劑在健康志愿者體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間過程均符合二室開放模型。兩種制劑的平均藥-時(shí)曲線詳見圖1；主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)詳見表3，表4。測(cè)定結(jié)果與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)基本一致。

圖1 受試制劑和參比制劑的平均藥-時(shí)曲線A-對(duì)乙酰氨基酚；B-重酒石酸氫可酮Fig 1 Mean plasma concentration-time curve of two preparationsA-paracetamol; B-hydrocodone bitartrate

2.6 相對(duì)生物利用度

將受試者口服受試制劑及參比制劑后的血藥濃度數(shù)據(jù)以梯形面積法計(jì)算AUC0-tn，根據(jù)血藥濃度-時(shí)間曲線末端血藥濃度點(diǎn)，以LnC對(duì)t進(jìn)行回歸，求得消除速率常數(shù)ke；t1/2ke= 0.693/ke；Cmax、tmax為試驗(yàn)的實(shí)測(cè)值，AUC0-∞= AUC0-tn＋Ctn/ke（tn為最后一次可檢測(cè)血藥濃度的采樣時(shí)間；Ctn為末次可測(cè)定樣本的藥物濃度）；CL/F= D/AUC0-∞（D為給藥劑量）；Vd/F= （CL/F/Ke），根據(jù)Fr= AUC受試制劑/AUC參比制劑×100%求算受試制劑的相對(duì)生物利用度。結(jié)果顯示，受試制劑中，對(duì)乙酰氨基酚的平均相對(duì)生物利用度為（93.04±12.06）%，重酒石酸羥可酮為（112.77±26.54）%。

表3 2種制劑中對(duì)乙酰氨基酚的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of paracetamol in two preparations

表4 2種制劑中重酒石酸氫可酮的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of hydrocodone bitartrate in two preparations

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及生物等效性分析

對(duì)受試制劑與參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，即將Cmax、AUC0-tn、AUC0-∞數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果詳見表5。

表5 對(duì)乙酰氨基酚和重酒石酸氫可酮AUC0-tn、AUC0-∞及Cmax雙向單側(cè)t檢驗(yàn)表Tab 5 Two one-side test of AUC0-tn, AUC0-∞ and Cmax of paracetamol and hydrocodone bitartrate

由表5可見，采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)分析計(jì)算Cmax、AUC0-tn、AUC0-∞，對(duì)乙酰氨基酚和重酒石酸氫可酮的T1、T2值均大于T0.1（18）= 1.717 1，顯示2種制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)在試驗(yàn)的批間均無顯著性差異（P＞ 0.05）。表明受試制劑與參比制劑生物等效。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-MS-MS法分析人血漿中對(duì)乙酰氨基酚和重酒石酸氫可酮的濃度，經(jīng)方法學(xué)考察得出的回收率和批內(nèi)、批間精密度均符合人體藥動(dòng)學(xué)研究和生物利用度測(cè)定的要求。采用質(zhì)譜檢測(cè)器，使檢驗(yàn)靈敏度大大提高；對(duì)乙酰氨基酚和重酒石酸氫可酮均采用沉淀蛋白法后揮干的方法處理血漿樣品，與文獻(xiàn)液液萃取[5]相比，操作簡(jiǎn)單，節(jié)約成本，且定量下限較低。試驗(yàn)制劑和參比制劑的AUC0-tn、AUC0-∞及Cmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析及雙單側(cè)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，兩種制劑在處方間與周期間無顯著性差異（P＞ 0.05）。兩種制劑的tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗(yàn)無顯著性差異（P＞ 0.05）。根據(jù)以上結(jié)果判定試驗(yàn)制劑和參比制劑具有生物等效性。

本研究中未出現(xiàn)與試驗(yàn)相關(guān)的嚴(yán)重不良事件，沒有受試者因?yàn)槌霈F(xiàn)不良事件而退出本研究，研究結(jié)果可為中國(guó)人合理使用國(guó)產(chǎn)復(fù)方氨酚氫可酮片提供藥代動(dòng)力學(xué)依據(jù)。

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