十味板藍根顆粒劑抗病毒作用的實驗研究

司梁宏，陶 震，劉 靜，劉 梅，邱 彥 （解放軍454醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210002）

十味板藍根顆粒是我院臨床常用的自制中藥制劑（南制字（2006）F54007號），由板藍根、大青葉、金銀花、連翹等十味中藥材組成，主要用于感冒引起的發(fā)熱、惡寒、頭痛、流涕、咽痛等癥。其方中君藥板藍根為十字花科植物菘藍（Isatis indigoticaFort.）的干燥根，性寒味苦，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，臨床上廣泛用于治療流感、病毒性肝炎、帶狀皰疹、腮腺炎等病毒感染性疾病。作為一種重要的抗病毒藥物，板藍根對多種病毒具有抑制感染及增殖的作用[1-4]。十味板藍根顆粒所含其他主藥均為清熱解毒中藥，研究其抗病毒作用可為臨床應用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

十味板藍根顆粒（解放軍454醫(yī)院藥劑科自制，規(guī)格：15 g/袋，批號 20080331）；陽性對照藥：利巴韋林注射液（上海信誼金朱藥業(yè)有限公司，1 mL∶100 mg，批號 080951）。

胰蛋白酶（Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基，MEM培養(yǎng)基（HyClone公司）；胎牛血清（杭州四季青有限公司）；細胞培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM；細胞維持液為含有2%胎牛血清的DMEM；常規(guī)加入100 u·mL-1的青霉素、鏈霉素（Sigma公司）。

1.2 細胞株與病毒株

Hep-2細胞株和Hela細胞株均購自中國科學院上海細胞生物學研究所?？滤_奇病毒B3株（CVB3）和單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）均購自中國預防醫(yī)學科學院病毒所。

1.3 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Forma Scien-tific公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；超凈工作臺（上海值歐凈化設備有限公司）；DL-360A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

2 方法

2.1 溶液的制備

將十味板藍根顆粒溶于維持液中，滅菌后配成濃度為100 mg·mL-1的溶液，按比例依次稀釋成4000，2000，1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1的溶液；利巴韋林注射液用維持液稀釋至濃度分別為1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1的溶液；溶劑對照組不加藥物，加入細胞維持液。

2.2 病毒毒力測定

以細胞病變效應法（CPE法）測定50%組織細胞感染劑量（TCID50）。細胞病變率達50%及以上的培養(yǎng)孔為病變孔，細胞病變率小于50%者為非病變孔，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的TCID50[5]。

2.2.1 CVB3病毒毒力測定 常規(guī)方法培養(yǎng)Hep-2細胞，將對數(shù)生長期的Hep-2細胞經(jīng)胰酶消化后，制成5×104個·mL-1的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，置5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。待細胞長滿單層后,每孔接種MEM培養(yǎng)基稀釋的不同濃度（10-1～10-8）的CVB3病毒液。每個濃度接種8個孔，每孔0.1 mL，同時設正常細胞對照。于37 ℃吸附2 h后棄上清，加入細胞維持液連續(xù)培養(yǎng)96 h，每天于倒置顯微鏡下觀察細胞病變程度（CPE），測定其TCID50。

2.2.2 HSV-Ⅱ病毒毒力測定 常規(guī)方法培養(yǎng)Hela細胞，將對數(shù)生長期的Hela細胞經(jīng)胰酶消化后，制成5×104個·mL-1的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，置5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。待細胞長滿單層后,每孔接種MEM培養(yǎng)基稀釋的不同濃度（10-1～10-8）的HSV-Ⅱ病毒液。設復孔、對照及測定方法同“2.2.1”項。

2.3 藥物的細胞毒性測定

將對數(shù)生長期的Hep-2細胞和Hela細胞消化計數(shù)后，接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞長滿單層后,分別加入8個不同濃度的十味板藍根顆粒溶液（4000，2000，1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1）和利巴韋林6個不同濃度的的藥物溶液（1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1），每個濃度4個孔，每孔0.15 mL，同時設正常細胞對照。置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)96 h，每天于倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況，測定藥物的最大無毒濃度（TD0）[6-7]。

2.4 十味板藍根顆粒劑的抗病毒實驗

參考相關文獻[6-7]進行實驗。待96孔培養(yǎng)板Hep-2細胞長滿單層后，每孔以100 TCID50的CVB3感染Hep-2細胞；在另一96孔培養(yǎng)板的Hela單層細胞內，每孔以100 TCID50的HSV-Ⅱ感染Hela細胞；于37 ℃吸附2 h后均棄去病毒液，分別加入6個不同濃度（1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1）的十味板藍根溶液和利巴韋林藥液，每個濃度4個孔，同時均設溶劑對照、病毒對照及正常細胞對照，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)96 h，每天于倒置顯微鏡下觀察細胞病變，記錄病變情況。當病毒對照達到“++++”時，判定結果，如果細胞對照生長良好，加入藥物的細胞出現(xiàn)“+++”以上病變時，可判定該濃度的藥物無抗病毒的作用。

3 結果

3.1 病毒毒力測定結果

以CVB3和HSV-Ⅱ的不同濃度（10-1～10-8）稀釋病毒液分別接種培養(yǎng)細胞，觀察細胞病變CPE（50%以上明顯病變?yōu)榧毎∽兛祝?，計算CVB3病毒的TCID50為10-6.5，HSV-Ⅱ病毒的TCID50為10-5.7。

3.2 藥物的細胞毒性測定結果

十味板藍根顆粒劑對Hep-2細胞和Hela細胞毒性均較低，最大無毒濃度均為1 mg·mL-1；而利巴韋林在所設試驗濃度下未觀察到細胞毒性反應。細胞毒性鏡檢結果見表1。

表 1 十味板藍根顆粒劑的細胞毒性結果Tab 1 Cytotoxicity effect of the compound radix isatidis granules to cells

3.3 十味板藍根顆粒劑的抗病毒實驗

實驗結果表明：各濃度藥物對CVB3和HSV-Ⅱ病毒均有一定的抑制作用，藥物濃度在250、125和63μg·mL-1時，十味板藍根顆粒劑對病毒致細胞病變可產生不同程度的抑制作用，但均不如利巴韋林。利巴韋林濃度500 μg·mL-1時可以完全抑制病毒所致細胞病變。十味板藍根顆粒劑濃度在500 μg·mL-1以上時，可以明顯抑制CVB3病毒對Hep-2細胞的致病變作用，抑制HSV-Ⅱ病毒對Hela細胞的感染致病變作用，對Hep-2和Hela細胞有保護作用，并且隨著藥物濃度的增加，CPE特征逐漸減弱，病毒抑制率（細胞存活率）明顯升高。鏡檢結果分別見表2、表3。

表 2 十味板藍根顆劑抗CVB3病毒感染Hep-2細胞的作用Tab 2 Antiviral activity effect of the compound radix isatidis granules to CVB3 in vitro

表 3 十味板藍根顆粒劑抗HSV-Ⅱ病毒感染Hela細胞的作用Tab 3 Antiviral activity effect of the compound radix isatidis granules to HSV-Ⅱ in vitro

4 討論

HSV-Ⅱ和CVB3均是引起呼吸系統(tǒng)感染的重要病原，可在嬰幼兒和老年以及免疫缺陷人群引起嚴重肺炎，甚至危及生命?，F(xiàn)有的病毒性疾病治療藥物主要是化學合成類，容易產生藥品不良反應和耐藥性。常用的抗病毒藥物利巴韋林可以有效抑制CVB3等病毒復制，但其屬于核苷類似物，毒性較大，而且還有致畸作用[8]。

十味板藍根顆粒是由十味中藥配伍而成的復方制劑，通過多種有效成分、多環(huán)節(jié)、多途徑地發(fā)揮協(xié)同作用而表現(xiàn)出抗病毒功效，其抗病毒作用是多種化學成分和機制綜合作用的結果，可能是總生物堿的直接抑制病毒作用、多糖成分的促進免疫和抗體生成作用、醇提部位的抗炎和縮短病程作用、有機酸部位的抗菌和抗內毒素作用等[9]。

本實驗采用病毒體外感染細胞模型，結果顯示，十味板藍根顆粒劑濃度在500 μg·mL-1時可明顯抑制病毒感染致細胞病變作用，當濃度分別達到125μg·mL-1和250 μg·mL-1時,十味板藍根顆粒劑顯示出抗HSV-Ⅱ病毒感染Hela細胞和抗CVB3病毒感染Hep-2細胞的作用,提示十味板藍根顆粒用于感冒的療效基礎可能與其抗病毒活性緊密相關。實驗結果也表明，十味板藍根顆粒劑的抗病毒整體效果不如利巴韋林好。但藥理實驗與臨床已證實，十味板藍根顆粒具有清熱解毒利咽、抗菌抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛及抗炎的功效；動物體內實驗也證明，十味板藍根顆粒能顯著降低啤酒酵母所致的大鼠直腸溫度升高，并能顯著減少醋酸所致小鼠腹痛的扭體次數(shù)，同時顯著延長小鼠熱板的痛閾時間，具有顯著的解熱和鎮(zhèn)痛作用[10]；對角叉菜膠及二甲苯所致腫脹有明顯的抑制作用，能顯著的抑制醋酸所致小鼠腹腔內炎性物質的滲出，對急性和慢性炎癥均有明顯的抑制作用[11]。

建議臨床上考慮采用利巴韋林與十味板藍根顆粒劑聯(lián)合治療上呼吸道感染，既能發(fā)揮利巴韋林抑制核糖核酸而達到廣譜抗病毒作用，又能體現(xiàn)十味板藍根顆粒劑清熱解毒、涼血利咽、疏風解表的功效，具體的臨床療效、毒副作用及不良反應等情況，還有待于臨床上進一步觀察。

志謝：本研究中的抗病毒實驗由南方醫(yī)科大學藥理學系徐江平教授課題組協(xié)助完成，特此表示感謝！

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