喉癌患者治療前后外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)及臨床意義

孟慶翔 謝景華 高雄輝 李 明 王 磊 李 鵬

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的上皮源性惡性腫瘤，目前臨床治療以根治性手術(shù)結(jié)合術(shù)前或術(shù)后輔助性放療為主，但療效評(píng)價(jià)缺乏客觀、敏感、特異的檢測(cè)指標(biāo)。喉癌致死的主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而上皮性腫瘤在侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段就可能有癌細(xì)胞入侵，進(jìn)入血液的癌細(xì)胞可表達(dá)多種上皮性特異性蛋白。巢式RTPCR可在1×107個(gè)單核細(xì)胞中檢出1～10個(gè)腫瘤細(xì)胞，敏感性、特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他方法［1］。本研究通過(guò)巢式RT-PCR法檢測(cè)喉癌患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA臨床治療前后的表達(dá)情況，結(jié)合臨床資料綜合分析，以期為喉癌局部復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)、指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

選擇2006年1月至2007年12月我院收治的喉癌患者48例，均為男性，年齡44～79歲，中位年齡56歲。48例患者中:聲門型34例，聲門上型14例;T1N0M012例，T2N0M09例，T3N0M012例，T3N1M08例，T4N0M02例，T4N1M05例。臨床分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期27例，術(shù)前臨床診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例。所有病例術(shù)前經(jīng)病理確診為鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 治療方案

48例患者全部接受手術(shù)治療，其中喉部分切除21例，全喉切除27例，行頸淋巴結(jié)清掃14例，術(shù)后行輔助性放療19例，放療計(jì)量50Gy。分別于術(shù)前和術(shù)后6、12、24個(gè)月抽取患者外周靜脈血。另抽取10例聲帶息肉患者為陰性對(duì)照，10例喉癌組織為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 隨訪結(jié)果

術(shù)后隨訪24個(gè)月，其中1例Ⅳ期患者術(shù)后24個(gè)月失訪。4例復(fù)發(fā):頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)3例(術(shù)后13、18和21個(gè)月，均為Ⅳ期);氣管造漏口周圍復(fù)發(fā)1例(術(shù)后21個(gè)月，Ⅳ期)，所有局部復(fù)發(fā)病例都經(jīng)病理證實(shí)并接受進(jìn)一步治療，無(wú)死亡病例。

1.4 主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、DEPC(上海生工生物工程公司)、Taq、dNTP(美國(guó)MBI公司)、DNaseⅠ、RNase(大連寶生物技術(shù)有限公司)、水飽和酚、氯仿、異丙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)室試劑以無(wú)菌去離子水配制，用于RNA提取試劑及器皿均以0.05%DEPC處理;引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［2～4］，引物由上海申友生物公司合成，引物序列為:CK19-A: 5'-GAGGTGGATTCCGCTCCGGGCA-3';CK19-B:5'-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCAG-3'CK19-C:5'-CGAGCAGAACCGGAA-3';CK19-D:5'-TGAGCCGCTGGTACTCCTGAT-3';CK20-A:5'-CAGACACACGGTGAACTATGG-3';CK20-B:5'-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3';CK20-C:5'-CTGTTTGTTGGCAATGAGAAAATGG-3';CK20-D:5'-GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT-3';β-actin同義鏈:5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3';βactin 反義鏈:5'-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3'。

1.5 方法

1.5.1 總RNA提取 取患者術(shù)前外周靜脈血3～5ml，枸櫞酸鈉抗凝，2h分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(the peripheral blood mononuclear cells，PBMNC);腫瘤組織以勻漿器研碎得細(xì)胞懸液。一步法(Trizol)提取細(xì)胞和組織的總RNA，-80℃保存待用(無(wú)RNA酶的DNaseⅠ去除混雜的DNA)。取5μl總RNA電泳觀察28S和18S亮帶，鑒定RNA提取質(zhì)量，分光光度計(jì)定量。以O(shè)D260/OD280為1.7～2.0及電泳帶28S∶18S約2∶1，表明所提取的RNA符合要求。

1.5.2 取1～2μg細(xì)胞總 RNA，70℃ 6min變性后，根據(jù)Takara RNA試劑盒進(jìn)行cDNA第1鏈合成。各取5μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行第1輪PCR，第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物 0.5μl行第 2輪 PCR，另有 10×PCR Buffer、dNTP及MgCl2等，反應(yīng)總體積均為25μl。CK19擴(kuò)增的第1輪PCR引物為A和B，反應(yīng)條件:94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)40 次;第2輪引物為 C和 D，退火溫度為52℃，余同第1輪。CK20擴(kuò)增的第1輪PCR引物為A和B，反應(yīng)條件:94℃變性 30s，63℃退火 1min，72℃延伸 30s，循環(huán) 35次;第2輪引物為C和D，退火溫度為62℃，余同第1輪。β-actin循環(huán)條件為 95℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán) 35 次，72℃延伸 10min。

1.5.3 結(jié)果觀察 取5μl第2輪PCR產(chǎn)物以1.8%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在1×TBE緩沖液里，100V，30min。紫外燈下觀察并拍照，在 303、319、及531 bp處出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)條帶判為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 11.0軟件包分析各組數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法對(duì)病例數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者外周血組、陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)情況

48例喉癌患者外周血CK19 mRNA陽(yáng)性18例，CK20 mRNA陽(yáng)性22例，兩者均陽(yáng)性11例，兩者均陰性者8例。10例喉癌組織CK19 mRNA陽(yáng)性10例，CK20 mRNA陽(yáng)性9例。10例陰性對(duì)照CK19 mRNA陽(yáng)性1例;CK20 mRNA陽(yáng)性0例。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組β-actin均表達(dá)。外周血組及陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA治療前后的表達(dá)情況

喉癌患者(除隨訪24個(gè)月內(nèi)1例失訪，4例復(fù)發(fā))術(shù)前CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)顯著高于術(shù)后6、12、24個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 喉癌患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA治療前后的表達(dá)情況

2.3 術(shù)前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)與喉癌復(fù)發(fā)的關(guān)系

47例患者(1例失訪)根據(jù)術(shù)后24個(gè)月內(nèi)腫瘤局部復(fù)發(fā)與否分為復(fù)發(fā)組與無(wú)復(fù)發(fā)組。復(fù)發(fā)組術(shù)前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)均為75%(3/4)，無(wú)復(fù)發(fā)組術(shù)前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)分別為34.5%(15/43)和44.2%(19/43)，復(fù)發(fā)組術(shù)前CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)高于無(wú)復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2。復(fù)發(fā)組術(shù)后6、12個(gè)月外周血 CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)與術(shù)前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 喉癌患者復(fù)發(fā)組與無(wú)復(fù)發(fā)組術(shù)前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)情況

3 討論

癌細(xì)胞在外周血中的微轉(zhuǎn)移是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要起始步驟。喉癌屬上皮源性惡性腫瘤，其復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響其遠(yuǎn)期療效的重要因素。細(xì)胞角蛋白(cytokeratins，CKs)在正常上皮、上皮源性腫瘤及其轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，正常情況下如果外周血中檢測(cè)出CK，提示上皮源性腫瘤細(xì)胞已轉(zhuǎn)移入血，并且存活為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。CK20、CK19是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的、最常見(jiàn)的上皮性組織特異性標(biāo)志物。被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、胃腸癌、肺癌及食管癌等上皮性惡性腫瘤淋巴結(jié)、骨髓以及外周血中微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)［5～8］，顯示了較好的敏感性和特異性。

李平棟等［9］研究認(rèn)為CK19 mRNA可作為腫瘤標(biāo)志物對(duì)喉癌和下咽癌的復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的早期診斷提供幫助。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)［10］:喉癌患者術(shù)前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的細(xì)胞分化程度無(wú)相關(guān)性，與喉癌的分型(原發(fā)部位)、T分期、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生有相關(guān)性。本研究選取術(shù)后6、12、24月作為外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA表達(dá)的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6、12、24月外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)均較術(shù)前顯著下降(P＜0.05)，表明根據(jù)喉癌的臨床分型、分期所采取的根治性治療方案對(duì)外周血微轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用，且該抑制作用在術(shù)后24個(gè)月內(nèi)是有效的，可為臨床治療的評(píng)價(jià)提供分子生物學(xué)水平上的依據(jù)。

在術(shù)后隨訪的24個(gè)月內(nèi)，除外1例失訪，其余47例患者中共有4例出現(xiàn)腫瘤術(shù)后局部復(fù)發(fā)，占8.5%(4/47)，與 Jung等［7］對(duì)乳腺癌的研究結(jié)果一致。本研究中復(fù)發(fā)組術(shù)前外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)高于無(wú)復(fù)發(fā)組(P＜0.05)，提示喉癌患者術(shù)前外周血微轉(zhuǎn)移增加了腫瘤局部復(fù)發(fā)的機(jī)會(huì)。進(jìn)一步分析復(fù)發(fā)患者外周血CK19 mRNA、CK20 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明，術(shù)前和術(shù)后6、12月外周血微轉(zhuǎn)移差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明根治性治療方案仍不能降低部分患者的外周血微轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，尤其是術(shù)前外周血CK19 mRNA與CK20 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)者和術(shù)后上述指標(biāo)持續(xù)陽(yáng)性表達(dá)者。這與Chen等［11］對(duì)肺癌的研究結(jié)果相一致。但是由于本組48例喉癌患者術(shù)后24個(gè)月內(nèi)僅有4例局部復(fù)發(fā)，病例數(shù)較少，上述結(jié)論有待大樣本資料的進(jìn)一步研究證實(shí)。對(duì)于10例陰性對(duì)照中出現(xiàn)的1例CK19 mRNA陽(yáng)性表達(dá)，不排除在靜脈采血過(guò)程中的采血針頭被上皮源性組織的污染，從而產(chǎn)生的假陰性表達(dá)。

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