芬太尼對(duì)人肝癌細(xì)胞bel-7404生長(zhǎng)與凋亡的影響

鄒春云 阮 林 張 援

阿片受體激動(dòng)劑嗎啡是臨床常用的鎮(zhèn)痛藥物，廣泛應(yīng)用于各種癌痛患者，療效確切，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞是促進(jìn)其生長(zhǎng)還是誘導(dǎo)其凋亡尚存在爭(zhēng)議［1～4］，這在一定程度上限制了嗎啡的臨床應(yīng)用。近年來(lái)，阿片受體激動(dòng)劑芬太尼作為一種常用麻醉性鎮(zhèn)痛藥物，正逐漸應(yīng)用于癌痛患者，但該藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察芬太尼對(duì)人肝癌細(xì)胞bel-7404增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

枸椽酸芬太尼注射液(批號(hào):090501，湖北宜昌人福藥業(yè)有限公司)，人肝癌細(xì)胞bel-7404引自中科院上海生物研究所，由廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤防治研究所培養(yǎng)。主要培養(yǎng)試劑包括小牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液，胰蛋白酶為GIBCO產(chǎn)品，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自吉泰科技有限公司。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。儀器包括ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BIOKIT公司)、FACScalibur型流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))和Axiovert200型倒置顯微鏡(Zeiss公司，德國(guó))等，細(xì)胞周期分析軟件(Beckman公司，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種于含100μg/m1青霉素、100μg/m1鏈霉素和10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于含5%CO2、飽和濕度、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞形成單層鋪滿70% ～80%時(shí)，用0.25%胰酶常規(guī)消化，以1∶3～1∶5傳代1次。

1.2.2 噻唑藍(lán)還原法(MTT)及顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×103個(gè)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿80%后，棄培養(yǎng)液，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別施加濃度為5、50、500、5 000ng/ml的芬太尼，各組復(fù)設(shè)空白對(duì)照孔(僅加培養(yǎng)基)，各濃度設(shè)4個(gè)平行孔。培養(yǎng)24h后，取出96孔培養(yǎng)板，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，加入新鮮配制5mg/ml的MTT20μl/孔，孵育4h，吸盡各孔內(nèi)殘余液體，加入二甲基亞砜(DMSO)200μl/孔，振蕩10min，使微小黑色結(jié)晶溶解，形成均勻藍(lán)紫色溶液。采用酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm下測(cè)定各孔吸光度值(A)，以不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)基的孔調(diào)零。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bel-7404細(xì)胞，將2×105/ml細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，1ml/孔，實(shí)驗(yàn)組施加濃度分別為為5、50、500、5 000ng/ml的芬太尼，各組復(fù)設(shè)空白對(duì)照孔(僅加培養(yǎng)基)3孔/組，待細(xì)胞長(zhǎng)到約80%時(shí)，收集細(xì)胞，參照 annexin VFITC試劑盒說(shuō)明書方法操作，在488nm的激發(fā)波長(zhǎng)下采用FACScalibur流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 細(xì)胞周期分析 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bel-7404細(xì)胞，將細(xì)胞以2×105/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板，同樣設(shè)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組與1個(gè)對(duì)照組，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%后，收集細(xì)胞，參照試劑盒說(shuō)明書操作，采用FACScalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行單色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，用細(xì)胞周期分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bel-7404細(xì)胞，將細(xì)胞以1×103/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板，芬太尼孵育7 d，以 PBS洗滌細(xì)胞2次，甲醇固定5min，結(jié)晶紫染色15 min，在Axiovert200型倒置顯微鏡下觀察克隆數(shù)，≥50個(gè)細(xì)胞計(jì)為1個(gè)克隆，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各樣本間比較采用單因素方差分析，多重比較使用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芬太尼對(duì)人肝癌細(xì)胞bel-7404生長(zhǎng)、凋亡與克隆形成率的影響

各實(shí)驗(yàn)組人肝癌細(xì)胞bel-7404 MTT值和克隆形成率明顯低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或0.05)。芬太尼濃度≥50ng/ml時(shí)，隨著濃度的增加，凋亡率逐漸升高，MTT值、克隆形成率逐漸降低，各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 各組MTT值、細(xì)胞凋亡率及克隆形成率結(jié)果()

表1 各組MTT值、細(xì)胞凋亡率及克隆形成率結(jié)果()

注:對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組比較，*P＜0.05。

組別MTT值(n=4)凋亡率(%)(n=3)克隆形成率(%)(n=3)對(duì)照組 0.609±0.015* 10.71±1.8* 12.59±0.32*F1 0.572±0.010 26.27±2.08 10.48±0.43 F2 0.546±0.006 28.88±1.06 8.06±0.37 F3 0.502±0.007 32.10±1.4 6.66±0.28 F4 0.481±0.007 47.27±1.33 4.48±0.45

2.2 芬太尼對(duì)細(xì)胞周期的影響

各實(shí)驗(yàn)組對(duì)bel-7404細(xì)胞周期的作用不完全相同(P＜0.01)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，細(xì)胞周期分析顯示芬太尼干預(yù)細(xì)胞后實(shí)驗(yàn)組隨濃度增加，G0/G1期比例逐漸增加，S期、G2/M期細(xì)胞比例逐漸減少，與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組在G1期均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，G2期除5ng/ml與500、5 000ng/ml組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)外，其余各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，S期除5ng/ml與50ng/ml組兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07)外，其余各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 不同濃度的芬太尼對(duì)人肝癌bel-7404細(xì)胞周期的變化(，%)

表2 不同濃度的芬太尼對(duì)人肝癌bel-7404細(xì)胞周期的變化(，%)

注:對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組比較，*P＜0.05。

組別 G1 G2S對(duì)照組 48.60±1.54* 19.37±1.2* 32.06±1.45*F1 62.98±2.08 10.96±1.12 26.06±1.08 F2 66.85±1.07 9.30±0.89 23.84±0.39 F3 71.05±1.38 8.18±0.88 20.71±2.15 F4 75.64±1.89 7.74±0.91 16.62±1.00

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈多角形或梭形，細(xì)胞質(zhì)豐富，生長(zhǎng)旺盛，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片。加入不同濃度的芬太尼后，隨著濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞開始變小、變圓，折光性增強(qiáng)，脫壁細(xì)胞逐漸增多，漂浮在培養(yǎng)基中。見圖1a，1b。

圖1a 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)(10×40)

圖1b 實(shí)驗(yàn)組不同芬太尼濃度下細(xì)胞形態(tài)(10×40)

3 討論

芬太尼作為一種臨床常用的阿片受體激動(dòng)劑，其廣泛的藥理作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，在治療惡性腫瘤方面，有研究表明該藥能明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖［5］，并可抑制人胃癌細(xì)胞活力［6］，但該藥對(duì) bel-7404細(xì)胞是否存在抗增殖效應(yīng)尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組人肝癌bel-7404細(xì)胞MTT值和克隆形成率明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，提示不同濃度的芬太尼對(duì)bel-7404細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用。當(dāng)芬太尼濃度≥50ng/ml時(shí)，隨著濃度的增加，凋亡率逐漸升高，MTT值、克隆形成率逐漸降低，提示高濃度的芬太尼對(duì)bel-7404細(xì)胞的生長(zhǎng)具有更加明顯的抑制作用。在形態(tài)學(xué)方面，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芬太尼處理的細(xì)胞，其活力下降，細(xì)胞變小且形態(tài)不均，貼壁能力降低，且呈劑量依賴性特征。

為了進(jìn)一步了解芬太尼引起bel-7404細(xì)胞凋亡的機(jī)制，我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組bel-7404細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，靜止期(G0/G1期)細(xì)胞增多，DNA合成活躍期(S期)和有絲分裂(G2/M)期細(xì)胞減少，反映細(xì)胞增殖狀況的S期細(xì)胞比率在經(jīng)芬太尼處理24h后明顯降低，表明芬太尼能抑制bel-7404細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化。由于細(xì)胞的增殖速度主要與G1期的長(zhǎng)短有關(guān)，阻滯細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期就可以抑制細(xì)胞增殖。因此，芬太尼抑制人肝癌細(xì)胞bel-7404生長(zhǎng)的原因之一可能是抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，結(jié)果與部分報(bào)道一致［5］。但也有研究表明［7］，阿片類藥物可以與細(xì)胞表面μ受體結(jié)合，β受體進(jìn)而與G蛋白三聚體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)生和釋放，下調(diào)NK-KB和bcl-2的表達(dá)，上調(diào)bax和p53的表達(dá)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。劉志恒等［8］研究也推測(cè)，芬太尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)與細(xì)胞表面μ受體結(jié)合而發(fā)揮作用。由此可見，芬太尼可能具有組織特異性及腫瘤選擇性，對(duì)不同腫瘤的作用方式不盡相同。

綜上所述，芬太尼在體外可劑量依賴性抑制人肝癌bel-7404細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制之一可能是誘導(dǎo)細(xì)胞周期，尤其是G0/G1期阻滯。

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