高效液相色譜-熒光法測定谷物類農產品中阿維菌素、?，斁睾鸵辆S菌素的多殘留量

周海明

(浙江省嘉興市種植業(yè)技術推廣總站，浙江 嘉興 314411)

自1985年阿維菌素(abamectin，ABA)是阿維菌素投入農藥市場后，通過對母體進行半合成化學結構改造，已開發(fā)了伊維菌素(ivermectin，IVM)、?，斁?emamectin，EMA)、道拉菌素(dormectin)、埃珀利諾菌素(eprinomectin)和色拉菌素(selamectin)等系列衍生品種，形成一大類阿維菌素類農藥［1－2］。該類農藥具有殺蟲譜廣、殺蟲活性高、易與多數(shù)農藥混配使用等優(yōu)點。阿維菌素類農藥在我國農業(yè)生產已廣泛地應用，是我國目前使用范圍最廣的殺蟲劑之一［3］。自2008年我國農業(yè)部批準阿維菌素和?，斁卦谒旧a上使用，阿維菌素類農藥已在水稻、小麥、玉米等大田作物上大量使用。2008年威遠生化公司的阿維菌素產品-藍銳在水稻上銷量已突破億元。

目前世界各國農產品中阿維菌素類農藥的最高殘留限量(MRL值)已有標準限定［4］。由于檢測靈敏度高且不需要昂貴的儀器，液相色譜-熒光法(HPLC-FD)已成為目前最常用的阿維菌素類農藥殘留檢測方法［5－7］。在文獻報道中，已有很多關于畜產品［8］、蔬菜［9］、水［10］等樣品中阿維菌素類農(獸)藥殘留分析的論文發(fā)表，但對于谷物類農產品中阿維菌素類農藥殘留分析的研究還比較少［11］，并且多是單殘留分析。本文通過研究建立了同時檢測谷物類農產品中阿維菌素、?，斁睾鸵辆S菌素的多殘留分析方法，為谷物類農產品中阿維菌素類農藥殘留分析提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters 2696 Alliance高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters 474掃描熒光檢測器(美國Waters公司)，超純水器(美國 Milli-Q公司)，Kultra turrax高速勻質機(德國 IKA公司)，NEVAPTM111氮吹儀(美國 Organomation Associates Inc公司)，KQ-500B型超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

阿維菌素、?，斁?、伊維菌素、三氟乙酸酐(TFAA)和N-甲基咪唑(NMIM)均為分析純試劑(美國Sigma-Aldrich公司)，乙腈、甲醇、丙酮均為HPLC級產品(德國默克Merck公司)，氯化鈉為國產分析純產品。

1.3 標準溶液配制

儲備液:稱取阿維菌素、?，斁?、伊維菌素3種標樣各10 mg，用過無水硫酸鈉的乙腈溶解，分別配成質量濃度為100 mg·L－1標準溶液作為儲備液。

標準工作系列:分別移取一定體積的阿維菌素、埃瑪菌素、伊維菌素標準儲備液，用無水乙腈分別配制成 10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L－1的混合標準溶液。

1.4 樣品前處理

糙米、小麥和玉米樣品先用粉碎機粉碎，再過100目(0.149 mm)篩，放在－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩蚀_稱取粉碎樣品20 g放入250 mL平底玻璃瓶中，加入10 mL水和50 mL乙腈。在高速勻質器以14 000 r·min－1處理2 min后，提取樣品在超波清洗機上超聲輔助提取處理15 min，然后在10 000 r·min－1條件下離心5 min，上清液裝入預裝5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中。具塞量筒劇烈震蕩5 min后靜置30 min，使乙腈相和水相分層。從乙腈相中吸取20 mL提取液轉移至25 mL玻璃試管。提取液在氮吹儀上吹干后，試管中加入0.5 mL過無水硫酸鈉的乙腈，在超聲波清洗機上超聲1 min，使農藥殘留完全溶于乙腈。

1.5 柱前衍生化

在避光條件下，分別把0.1 mL N-甲基咪唑和0.2 mL三氟乙酸酐按先后順序加入裝有0.5 mL待衍生化樣品或標準溶液試管中，振蕩搖勻后靜置反應30 min。試管中再加入1.2 mL甲醇搖勻，避光反應1 h后，過0.45 μm有機濾膜進行 HPLC-FD測定。

1.6 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm);流動相:起始為水-乙腈-甲醇(體積比5∶10∶85)，5 min后為乙腈-甲醇(體積比20∶80)，流速為1.0 mL·min－1。檢測波長:熒光激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長475 nm。柱溫:40℃。進樣量:20 μL。定量方法:外標法(峰面積)。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

阿維菌素類藥物是弱極性化合物，在水中的溶解度低，易溶于乙腈、丙酮、甲醇、乙醇等極性有機溶劑。以糙米為代表樣品，分別研究不同有機溶劑(丙酮、乙腈、甲醇和正己烷)對阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的提取效率(表1)。結果發(fā)現(xiàn)，用乙腈提取的平均添加回收率最高，變異系數(shù)最小。丙酮提取液雜質多，易干擾目標物測定，變異系數(shù)較大，其原因可能是丙酮的極性比乙腈強，易把樣品中淀粉、蛋白質、糖類化合物等極性雜質提取出來，同時由于丙酮在常溫下?lián)]發(fā)性非常強，影響提取液的體積計算，從而造成回收率變異系數(shù)大。正己烷的回收率最低，一方面是正己烷對阿維菌素類農藥提取能力不夠，另一方面可能因為正己烷是強非極性溶劑，它無法浸潤進入樣品，與樣品接觸不充分。在實驗中發(fā)現(xiàn)利用氯化鈉鹽析作用很難使甲醇與水相完全分離，所以甲醇不適用作此方法。

考慮到糙米、小麥和玉米都是干燥樣品，單獨采用乙腈提取時，溶劑在樣品上無法充分浸潤展開，難以保證溶劑與樣品的充分接觸，所以采用乙腈與水混合作為提取溶劑，以促進提取溶劑與樣品的相互接觸。與此同時，采用超聲輔助萃取方法加速樣品中阿維菌素類農藥溶于提取溶劑，提高提取效率。

表1 不同提取溶劑對3種阿維菌素類農藥的回收率(n=3)

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素是同類化合物，化學結構與性質都非常相近，因此它們在色譜分離上有一定難度，對色譜分離條件要求較高。為了使它們在色譜柱上有適當?shù)谋Ａ魰r間和有效分離，選用了Kromasil C18column(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)、SB-C8column(150 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)、Inertsil ODS-3 column(150 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)等不同類型的反相色譜柱進行實驗。實驗結果表明，這3種阿維菌素類農藥在C18色譜柱上峰形對稱，重現(xiàn)性好，有合適的保留時間。

在優(yōu)化流動相實驗中發(fā)現(xiàn)，用乙腈或甲醇與水的固定比例作流動相難以有效分離這3種性質相近的農藥，同時又要避開雜質峰干擾。因此，采用了乙腈-甲醇-水三元梯度洗脫程序對它們進行色譜分離。通過實驗優(yōu)化確定了最佳流動相為:起始為水-乙腈-甲醇(體積比 5∶10∶85)，5 min 后為乙腈-甲醇(體積比20∶80)，持續(xù)10 min后結束檢測;流速一直保持在1.0 mL·min－1;柱溫為40℃。由圖1可見:阿維菌素、?，斁睾鸵辆S菌素在小于12 min保留時間內都能出峰，獲得了很好的分離效果。

圖1 阿維菌素類農藥的標樣色譜

2.3 標準曲線

在上述色譜條件下，分別檢測質量濃度為10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L－1阿維菌素、埃瑪菌素和伊維菌素的混合標準溶液，以農藥質量濃度與峰面積做線性回歸得標準曲線方程和線性相關系數(shù)(表 2)。在 10 ～5 000 μg·L－1范圍內農藥的峰面積與其質量濃度呈良好的線性關系，它們的相關系數(shù)(R2)均大于0.999。以4倍信噪比(S/N=4)為計，可分別得出阿維菌素、?，斁睾鸵辆S菌素的最低檢測限分為 5，10，5 μg·L－1。由此可算出，谷物類農產品中阿維菌素、?，斁睾鸵辆S菌素的最低檢出質量濃度分別1，2，1 μg·L－1，低于其MRL值一個數(shù)量級以上。因此，該方法檢測范圍和靈敏度完全能滿足殘留分析要求。

2.4 添加回收實驗

將阿維菌素、?，斁睾鸵辆S菌素的混合標準液分別添加到糙米、小麥和玉米樣品中，添加質量分數(shù)為0，10，100，1 000 mg·kg－14個組，批內有3個重復，共完成3次批間處理。為了保證添加質量濃度與樣品混勻，添加農藥后樣品避光密封振蕩過夜，采用上述檢測方法進行檢測實驗。研究結果(圖2－3)表明:經過前處理和柱前熒光衍生反應后，糙米、小麥和玉米樣品的色譜圖中雜質峰非常少，對這3種目標物檢測結果不會產生影響。由表3－5可見:阿維菌素在糙米、小麥和玉米中的添加回收率為85.1%～109.3%，精密度為3.10%～12.44%，準確度為－14.9% ～9.3%;埃瑪菌素的添加回收率為85.2% ～93.4%，精密度為2.04% ～9.03%，準確度為－14.8% ～－6.6%;伊維菌素的添加回收率為86.1%～97.3%，精密度為2.98% ～11.07%，準確度為 －13.3% ～－7.4%。由此可見，研究方法的回收率、精密度和準確性完全達到殘留分析要求。

表2 農藥的保留時間、標準曲線及線性相關系數(shù)

圖2 空白對照糙米樣品的色譜

圖3 添加農藥后糙米樣品的色譜

表3 阿維菌素類農藥在糙米樣品中的添加回收率、精密度及準確度(n=3)

表4 阿維菌素類農藥在小麥樣品中的添加回收率、精密度及準確度(n=3)

表5 阿維菌素類農藥在玉米樣品中的添加回收率、精密度及準確度(n=3)

2.5 檢測真實樣品

采用本文方法對130個市場抽查的糙米樣品進行檢測。結果(圖4)表明，有1個樣品檢出阿維菌素質量分數(shù)為8.4 μg·kg－1，檢出率為0.8%，?，斁睾鸵辆S菌素未檢出。

3 小結

采用HPLC-FD檢測糙米、小麥、玉米等谷物類農產品上阿維菌素、?，斁睾鸵辆S菌素的多殘留分析方法。以乙腈作為提取溶劑能充分提取阿維菌素類農藥殘留，同時減少雜質提取。流動相采用乙腈/甲醇/水三元梯度洗脫程序后，3種阿維菌素類農藥在合適的保留時間內能獲得有效分離，同時避開雜質干擾。采用高效的熒光衍生化后，該方法具有很高的靈敏度，最低檢出濃度低于MRL值近一個數(shù)量級以上。添加回收實驗表明本文方法的選擇性高，準確性和精確性都能達到農藥殘留分析要求，在檢測真實樣品上得到很好的應用。

圖4 抽檢糙米樣品的檢測色譜

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