鋅對(duì)酒精性肝損害小鼠保護(hù)作用的研究

張素云，許秀舉

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040

隨著人們生活水平的提高及經(jīng)濟(jì)活動(dòng)日趨活躍，飲酒人數(shù)越來(lái)越多，現(xiàn)在飲酒已經(jīng)成為很多人生活中必不可少的一部分。但酒精引起的相關(guān)疾病也逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。酒精可引起肝臟、胃、心臟、腦組織等多個(gè)臟器的損害，尤其是酒精性肝病發(fā)病率最高。酒精性肝病已成為男性的第四大死因[1]。目前，解酒保肝已成為醫(yī)學(xué)界與生物界迫切需要解決的問(wèn)題。本研究采用一次大劑量白酒灌胃的方法，制作白酒模型[2]，探討急性大量飲酒對(duì)肝組織酶的影響以及不同劑量鋅對(duì)急性酒精性肝損害小鼠的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，均為雄性，體重18～24 g，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，為清潔級(jí)動(dòng)物。合格證號(hào)為SCXKC蒙2002-0001。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖酸鋅，北京高科藥物有限責(zé)任公司生產(chǎn)；紅星二鍋頭酒，紅星股份有限公司生產(chǎn)；谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、肝組織谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測(cè)定試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將50只健康昆明種小鼠（均為雄性）隨機(jī)分為5組，每組各10只，分別為空白對(duì)照組，白酒對(duì)照組和鋅低、中、高3個(gè)劑量組，含鋅劑量分別為1.25、2.50、5.00mg/kg。其中空白對(duì)照組和白酒對(duì)照組飲用自來(lái)水；其他各組飲用自由溶于水的鋅溶液。各組大鼠均采用自由飲用的方式，連續(xù)飲用30 d。在實(shí)驗(yàn)期間，每周稱一次體重，觀察小鼠的一般狀況。第30天時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行空腹白酒灌胃實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用一次大劑量白酒灌胃的方法[2]，按12 ml/kg體重對(duì)各組小鼠進(jìn)行灌胃，16 h后處死小鼠，取小鼠肝組織，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 肝組織勻漿的制備 處死小鼠后立即打開(kāi)腹腔取出肝組織，制成組織勻漿。組織勻漿用低溫離心機(jī)離心10 min，取適量上清液進(jìn)行MDA、GSH-Px、ALT、谷AST的測(cè)定。

1.2.3 各項(xiàng)生化指標(biāo)測(cè)定 肝勻漿谷胱甘肽活性、MDA含量測(cè)定：采用二硫代對(duì)硝基苯甲酸法（DTNB法）測(cè)定肝勻漿中GSH-Px，硫代巴比妥酸法（TBA法）測(cè)定肝勻漿中MDA含量。肝勻漿ALT、AST含量測(cè)定：采用賴氏法測(cè)定，按試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示。采用單因素方差分析 （One-Way ANOVA）比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有小鼠活動(dòng)正常，健康狀況良好，無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，各組小鼠體重逐漸增加，但各組間平均體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

2.2 小鼠肝組織酶測(cè)定結(jié)果

見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，白酒對(duì)照組及各劑量鋅組與空白對(duì)照組比較，肝組織谷胱甘肽明顯下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各劑量鋅組與白酒對(duì)照組比較稍有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明飲白酒可使肝組織受損，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶明顯下降，但葡萄糖酸鋅干預(yù)對(duì)肝組織的谷胱甘肽保護(hù)作用不明確。

表1 小鼠肝組織谷胱甘肽測(cè)定結(jié)果[±s，mmol/（kg·min）]

表1 小鼠肝組織谷胱甘肽測(cè)定結(jié)果[±s，mmol/（kg·min）]

注：P1值表示與白酒對(duì)照組比較，P2值表示與空白對(duì)照組比較

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2.3 小鼠肝組織丙二醛測(cè)定結(jié)果

見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)，白酒對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，肝組織丙二醛明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各劑量鋅組與白酒對(duì)照組比較明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說(shuō)明飲白酒可使肝組織受損，丙二醛明顯升高，經(jīng)葡萄糖酸鋅干預(yù)可使肝組織中丙二醛下降。

表2 小鼠肝組織丙二醛測(cè)定結(jié)果（±s，μmol/g）

表2 小鼠肝組織丙二醛測(cè)定結(jié)果（±s，μmol/g）

注：P1值表示與白酒對(duì)照組比較，P2值表示與空白對(duì)照組比較

P2值空白對(duì)照組白酒對(duì)照組鋅低劑量組鋅中劑量組鋅高劑量組組別 只數(shù)1010101010丙二醛測(cè)定值1.5861±0.70594.0310±1.40182.9256±1.25601.8177±0.87211.7688±0.7397 P1值0.0000.0070.0010.0010.0450.7220.7790.203

2.4 小鼠肝組織谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定結(jié)果

見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，白酒對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，肝組織谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同劑量鋅干預(yù)與白酒對(duì)照組相比，谷丙轉(zhuǎn)氨酶有所下降，僅高劑量鋅組與白酒對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明葡萄糖酸鋅對(duì)酒精性肝損害小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶影響與劑量相關(guān)。

表3 小鼠肝組織谷丙轉(zhuǎn)氨測(cè)定結(jié)果（±s，U/L）

表3 小鼠肝組織谷丙轉(zhuǎn)氨測(cè)定結(jié)果（±s，U/L）

注：P1值表示與白酒對(duì)照組比較，P2值表示與空白對(duì)照組比較

P2值組別 只數(shù)1010101010空白對(duì)照組白酒對(duì)照組鋅低劑量組鋅中劑量組鋅高劑量組谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定值22.2860±7.170835.3600±12.661927.6950±4.064324.1500±11.101222.2870±4.9897 P1值0.0320.2040.0650.0320.0080.3570.5540.722

2.5 小鼠肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定結(jié)果

見(jiàn)表4。從表4可以看出，白酒對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），不同劑量鋅干預(yù)與白酒對(duì)照組相比，谷草轉(zhuǎn)氨酶有所下降，中、高劑量鋅組與白酒對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明葡萄糖酸鋅對(duì)酒精性肝損害小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶有影響。

表4 小鼠肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定結(jié)果（±s，U/L）

表4 小鼠肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定結(jié)果（±s，U/L）

注：P1值表示與白酒對(duì)照組比較，P2值表示與空白對(duì)照組比較

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3 討論

酒精引起急慢性肝損害的原因非常復(fù)雜，研究普遍認(rèn)為與脂質(zhì)過(guò)氧化、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)等多種因素有關(guān)[3-4]。有研究證實(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化在酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5]，從某種角度上來(lái)講，脂質(zhì)過(guò)氧化是機(jī)體正常生理過(guò)程，但過(guò)度的脂質(zhì)過(guò)氧化卻可以造成肝臟損傷[6]。抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是減輕肝臟損害的有效途徑。目前，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有報(bào)道，N-乙酰半胱氨酸、卵磷脂及很多中藥，如三七、丹參、枳黃芳、決明子、鹿茸等對(duì)酒精性肝損傷具保護(hù)作用，其機(jī)制均與其抗氧化作用有關(guān)。但微量元素鋅對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用研究很少。鋅是人體內(nèi)的含量?jī)H次于鐵的15種微量元素之一，具有抗氧化作用，能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化或硫醇氧化，維持生物膜的正常生理功能。本研究利用鋅的抗氧化作用來(lái)觀察其對(duì)急性酒精性肝損害的營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用。MDA是氧自由基與生物膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，與氧自由基的量一致，GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用保護(hù)系統(tǒng)的主要成分，不僅是肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志，也反映體內(nèi)對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化拮抗能力的高低，所以，本研究以MDA和 GDH-Px作為反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化水平。ALT、AST是肝細(xì)胞受損后主要釋放的酶，其測(cè)定結(jié)果直接可反映肝細(xì)胞損傷程度，故本項(xiàng)研究將其列為觀察指標(biāo)。常用的鋅源包括無(wú)機(jī)鋅、有機(jī)合成鋅和有機(jī)鋅，它們的生物學(xué)效價(jià)存在很大差異。本項(xiàng)研究中所使用的是葡萄糖酸鋅，是有機(jī)合成鋅。

本研究結(jié)果顯示：①白酒可造成急性酒精中毒小鼠肝臟功能及脂質(zhì)過(guò)氧化損害。②鋅對(duì)酒精性肝損害小鼠具保護(hù)作用，并且與鋅劑量相關(guān)，在允許范圍內(nèi)，鋅劑量越大，保護(hù)作用越強(qiáng)。在本研究中，各劑量組葡萄糖酸鋅均可使谷胱甘肽過(guò)氧化物酶升高，但與白酒對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與理論不相符[4,7]，分析可能有以下原因：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的樣本數(shù)較少，結(jié)果離散度較大。②可能與鋅源類(lèi)型有關(guān)，不同鋅源吸收、利用度不同。③與乙醇處理的劑量和時(shí)間、動(dòng)物品系及小鼠灌白酒后處死時(shí)間有關(guān)。為此，在今后的科研工作中筆者建議盡量增加樣本量，選擇吸收、利用度更好的鋅源，如氨基酸螯合鋅，同時(shí)增加測(cè)定肝組織中酶的種類(lèi)，如一氧化氮、超氧化物歧化酶、乙醇脫氫酶，試圖找到更能反映鋅對(duì)酒精性肝損害起保護(hù)作用的酶類(lèi)，為鋅對(duì)酒精性肝損害起保護(hù)作用提供理論依據(jù)。

[1]Ronaid GT,Blar UB,Iimuro Y,et al.Role of kuffer cell,endotoxin,and free radicals in hepatoxicity due to prolonged alcohol consumption:studies in female and male rats[J].J Nutr,1997,127(suppl):903-906.

[2]段薈,付成效,縐瑾.黃芪對(duì)酒精性肝損傷小鼠MDAGSH和TG的影響及肝臟保護(hù)作用的研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2010,39(3):271-272.

[3]McClain CJ,Barve S,Barve S,et al.Tumor necnosis factor and alcoholic liver disease[J].Alcohol Clin Exp Res,1998,22(5 suppl):248-252.

[4]杜時(shí)雨,房龍.脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)大鼠急性酒精性肝損害中的作用[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2008,17(7):600-602.

[5]Arteel GE.Oxidants and antioxidants in alcohol-induced liver disease[J].Gastroenterology,2003,124(1):778-790.

[6]Hoek JB,Pastorino JG.Ethanol oxidative stress and cylokine-induced liver cell injury[J].Alcohol,2002,27(2):63-68.

[7]Enty B,Berson A,Pessayre D.Microvesicular steatosis and steatohepatitis role of mitochondrial dysfunction and lipid peroxidation[J].J Hepatol,1997,26(suppl 1):13-22.