HPLC法同時快速測定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度

崔艷麗，武 峰(1.北京市石景山醫(yī)院藥劑科，北京 100043;.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院臨床藥理基地，北京 100730)

萬古霉素、去甲萬古霉素同屬三環(huán)糖肽類抗生素，對革蘭陽性細(xì)菌有強(qiáng)大的抗菌作用，尤其對目前臨床較為棘手的嚴(yán)重耐藥金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染有較好療效，且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，因而深受臨床重視。由于萬古霉素和去甲萬古霉素具有耳、腎毒性，臨床應(yīng)用時常需進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(TDM)，特別是對于老年患者和腎功能不全者，需通過TDM來及時調(diào)整給藥方案，以避免耳、腎功能損害。萬古霉素、去甲萬古霉素的血藥濃度測定方法，已報道的有微生物法、熒光偏振免疫法和高效液相色譜法(HPLC)等。本研究擬通過建立適宜的HPLC-UV法，同時快速測定血清中萬古霉素和去甲萬古霉素濃度，以用于臨床TDM及藥代動力學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

萬古霉素對照品，含量:100%;去甲萬古霉素對照品，含量:83.4%，均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Hp1100型高效液相色譜儀，含 G1311A型四元泵、G1313A型自動進(jìn)樣器、G1314A型紫外檢測器、Agilent色譜工作站，Agilent公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取去甲萬古霉素及萬古霉素對照品，去離子水充分溶解得標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中去甲萬古霉素/萬古霉素的濃度為400/460 μg·mL－1。取不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以空白人血清稀釋至濃度為 80.7/92.0、40.4/46.0、20.2/23.0、8.1/9.2、4.0/4.6、2.0/2.3、0.8/0.9 μg·mL－1(去甲萬古霉素/萬古霉素)的血清標(biāo)本。同時稀釋得低、中、高3種濃度的質(zhì)控血清標(biāo)本，使其濃度分別為 57.7/65.7、14.1/16.1、3.0/3.5 μg·mL－1。

1.4 色譜條件

流動相:50 mM KH2PO4緩沖液∶乙腈 =90∶10(pH=2.5);色譜柱:Phenomenex C18柱(150 ×4.6 mm，5 μm);流速:1.0 mL·min－1;檢測波長:236 nm;柱溫:25 ℃。

1.5 樣本處理方法

取待測樣本 200 μL，加入 6% 高氯酸 180 μL，漩渦混合2 min，13 000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min;取上清液 300 μL，加入1.5 mm NaOH溶液 40 μL，漩渦混合 1 min，取上清液 20 μL 進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察

在本實驗條件下，萬古霉素和去甲萬古霉素分離度良好，無血清內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。去甲萬古霉素的保留時間約為6 min;萬古霉素的保留時間約為8 min，血清色譜圖見圖1。

圖1 萬古霉素和去甲萬古霉素的血清色譜圖Fig 1 HPLC Chromatograms of serum vancomycin and norvancomycin

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本，以去甲萬古霉素/萬古霉素的峰面積為縱坐標(biāo)，樣本濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線形回歸。結(jié)果顯示:去甲萬古霉素在0.8 ～80 μg·mL－1，萬古霉素 0.9 ～92 μg·mL－1的濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性。去甲萬古霉素的線性方程為:Y=10.678X－0.615，r=0.999 98;萬古霉素的線性方程為:Y=8.597X+5.585，r=0.999 94。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，本實驗的定量下限為去甲萬古霉素 0.8 μg·mL－1，萬古霉素0.9 μg·mL－1。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度

分別測定低、中、高3種濃度的血清質(zhì)控標(biāo)本各5組，計算準(zhǔn)確度和日內(nèi)精密度(RSD);連續(xù)測定5日，計算日間精密度。結(jié)果顯示，本方法測定血清去甲萬古霉素/萬古霉素的準(zhǔn)確度分別為97.79% ～104.82%及96.49% ～110.75%;日內(nèi)、日間精密度均＜8%，見表1。

2.4 穩(wěn)定性實驗

取低、中、高3種濃度的血清質(zhì)控標(biāo)本各3組，處理后將上清液在室溫分別放置4、24、48 h后重復(fù)測定，計算變異系數(shù)(CV%);將配制好的血清質(zhì)控標(biāo)本置于－40℃冰箱分裝保存，每隔1周重復(fù)測定1次，其中低、中、高濃度各測定3組，計算CV%。結(jié)果顯示，去甲萬古霉素和萬古霉素的血清標(biāo)本在上述情況下穩(wěn)定性良好，測定值CV%均＜10%，見表2。

表1 血清去甲萬古霉素/萬古霉素的準(zhǔn)確度及精密度(n=5)Tab 1 Degree of accuracy and precision of vancomycin and norvancomycin in serum(n=5)

表2 血清去甲萬古霉素/萬古霉素的穩(wěn)定性Tab 2 Stability of vancomycin and norvancomycin in serum

3 討論

目前臨床上主要應(yīng)用熒光偏振免疫法(FPIA)測定血清萬古霉素的藥物濃度。盡管FPIA法具有操作簡便，精密度高等諸多優(yōu)點，但有國外文獻(xiàn)認(rèn)為[1，2]，與 HPLC法相比，F(xiàn)PIA法所測萬古霉素濃度值容易偏高，其原因可能是由于萬古霉素的降解產(chǎn)物(CDP-1)與萬古霉素發(fā)生交叉反應(yīng)。在慢性腎功能不全的患者，由于萬古霉素排泄顯著延長，體內(nèi)CDP-1產(chǎn)生增多，F(xiàn)PIA所測濃度值偏高更易發(fā)生。日本學(xué)者Tanaka等的研究表明，在血透患者中，測定值偏高的情況更為明顯[1]。此外，F(xiàn)PIA標(biāo)準(zhǔn)血樣的穩(wěn)定性也可能影響測定結(jié)果，Morishige等人[2]曾對FPIA標(biāo)準(zhǔn)血樣穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，在4℃和25℃貯存30 d后，萬古霉素含量分別下降20%和60%。因此，有必要建立快速、準(zhǔn)確的HPLC法，以應(yīng)用于萬古霉素以及去甲萬古霉素的臨床TDM以及藥代動力學(xué)研究。

有關(guān)萬古霉素和去甲萬古霉素測定的HPLC方法，國內(nèi)外文獻(xiàn)中多采用反向色譜法和離子對色譜法[3-6]。由于離子對色譜法存在平衡時間長，不易洗脫等缺點，故本研究采取了的反向色譜法。在流動相的組成上，本實驗進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，采用乙腈為有機(jī)相，調(diào)節(jié)其與水相的比例為10∶90，并將pH值調(diào)至2.5，使萬古霉素和去甲萬古霉素與血清雜質(zhì)分離完全，且峰形良好，保留時間合理，提高了檢測效率。在檢測波長的選擇上，本文對比了280 nm(《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的檢測波長)和文獻(xiàn)中多采用的236 nm，發(fā)現(xiàn)兩藥在236 nm的吸收度均較280 nm處更為理想。

有關(guān)血樣處理方法，國內(nèi)文獻(xiàn)中曾使用乙腈:異丙醇沉淀血樣后，再用氯仿或二氯甲烷萃取上清液的方法進(jìn)行血樣提取，但提取方法較為繁瑣[3]。也有學(xué)者采用10%硫酸鋅溶液[4]和10%三氯乙酸溶液[5]直接沉淀血清蛋白的方法，但前者沉淀蛋白不完全，后者則內(nèi)源性干擾較多以致無法完全色譜分離。本實驗采用6%高氯酸作為沉淀劑直接沉淀蛋白，蛋白沉淀完全，操作簡單，且消耗血量極少(200 μL)。但由于高氯酸的強(qiáng)酸性可造成藥物在上清液的穩(wěn)定性減低，故本文采用NaOH調(diào)節(jié)上清液的pH值。

有文獻(xiàn)報道，去甲萬古霉素在血清中容易降解，穩(wěn)定性較差[7]。本研究對不同濃度的血清質(zhì)控樣本進(jìn)行了穩(wěn)定性實驗，結(jié)果表明，血清樣本處理后上清液在室溫放置48 h，以及血清標(biāo)本－40℃保存3周，去甲萬古霉素和萬古霉素的穩(wěn)定性均符合要求。

綜上所述，本實驗建立HPLC法同時測定去甲萬古霉素和萬古霉素的血藥濃度，方法快速簡捷、靈敏度高，經(jīng)考察準(zhǔn)確度和精密度良好，可滿足臨床開展TDM和進(jìn)行人體藥代動力學(xué)研究的需要。

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