X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白對米非司酮誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響

湯颯爽

(浙江省臺州市路橋中醫(yī)院，浙江 臺州 318000)

細胞凋亡研究是近年來生命科學(xué)研究的重點之一。X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X－linked inhibitor of apoptosis，XIAP)屬于凋亡抑制蛋白家族IAPs中8個成員中的一員。XIAP是其中抑制凋亡最有力的成員，相對分子質(zhì)量為57000，基因定位于Xq25，是含有497個氨基酸的蛋白，N－末端含有3個BIR(baculovirus IAP repeat)結(jié)構(gòu)域(BIR1，BIR2，BIR3)。XIAP 通過與 caspase－3，caspase－6，caspase－7直接結(jié)合，進一步抑制caspase的激活，從而抑制細胞凋亡;BIR3區(qū)可直接與caspase－9前體－C－末端的亞單位結(jié)合，抑制caspase－9的激活[1];XIAP還可通過核因子－κB(NF－κB)途徑上調(diào) XIAP，c－IAP1，c－IAP2，抑制 caspases的激活，阻斷細胞凋亡。另外，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，雌、孕激素與其受體的相互作用在婦科惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，并在某種程度上反映患者的預(yù)后。米非司酮(mifepristone)系人工合成的類固醇激素，為強效受體水平的孕激素受體拮抗劑、糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑，主要用于終止早期妊娠。近年來，研究發(fā)現(xiàn)米非司酮還具有抗腫瘤作用，可用于子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、婦科惡性腫瘤、腦膜瘤、膠質(zhì)瘤、前列腺癌等疾病的治療。宮頸癌是婦女常見惡性腫瘤之一。為了研究XIAP在HeLa細胞中的作用，本研究利用共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光分布情況，用米非司酮誘導(dǎo)凋亡，以流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡狀況，初步探討了XIAP對宮頸癌HeLa細胞的影響及其相互作用。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細胞系HeLa(購自ATCC)，由遵義醫(yī)學(xué)院中心實驗室傳代?？召|(zhì)粒pEGFPN1，pDsRed2－N1及其構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP－XIAP，pDsRed2－XIAP，由遵義醫(yī)學(xué)院病理實驗室保存。LipofectionTM2000(Invitrogen公司)。米非司酮購自浙江仙琚制藥股份有限公司;AnnexinⅤ－FITC購自晶美公司，流式細胞儀(BDFACBCalibur公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

取宮頸癌細胞系HeLa，培養(yǎng)于含10%新鮮小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃和5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長。

1.2.2 質(zhì)粒提取與鑒定

于LB培養(yǎng)液中加入硫酸卡那霉素(50 μg/mL);分別取150 μL pDsRed2－N1，pDsRed2－XIAP加入LB培養(yǎng)液中，于恒溫搖床中搖菌，質(zhì)粒提取，存于－80℃冰箱中。采用紫外分光光度計對DNA進行定量分析，根據(jù) A260/A280的比值反映DNA的純度，比值大于1.8且小于2.0時純度較高。重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)時，各試劑加入配制反應(yīng)體系，37℃孵育2 h，1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞系(HeLa)

細胞轉(zhuǎn)染步驟:轉(zhuǎn)染前24 h，經(jīng)細胞計數(shù)，用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染時細胞在培養(yǎng)板中生長至60% ～80%。配置溶液A(4 μg質(zhì)粒DNA用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基加至250 μL)和B(10 μL LipofectionTM2000用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基加至250 μL)，室溫放置5 min，混勻 A液和 B液，室溫下放置 20 min。將500 μL復(fù)合物加入培養(yǎng)液中，37℃孵育6 h后，換成新鮮的有血清培養(yǎng)基，于37℃繼續(xù)孵育，24～48 h后可觀察到報告基因的表達。

對貼壁生長的HeLa細胞分組:未處理組為常規(guī)培養(yǎng)的HeLa細胞;藥物對照組為加米非司酮終濃度40μmol/L;空白對照A組為轉(zhuǎn)染pDsRed2－N1質(zhì)粒無米非司酮處理，空白對照B組為轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒無米非司酮處理組;試驗A組為轉(zhuǎn)染pDsRed2－N1質(zhì)粒+米非司酮，試驗B組為轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒+米非司酮。加藥組均于37℃培養(yǎng)48 h，加入米非司酮4 h后收集細胞。

1.2.4 細胞凋亡狀況與轉(zhuǎn)染細胞效率檢測

細胞凋亡狀況:分別收集6組細胞，1000 r/min離心5 min，用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2次;重懸于4×Binding Buffer，使細胞密度為 1×106/mL;于 100 μL細胞懸液中加入 AnnexinⅤ－FITC 5 μL，室溫避光孵育 15 min;加入磷酸鹽緩沖液 100 μL，在流式細胞儀上檢測。

轉(zhuǎn)染細胞效率:將轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒的細胞于37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，收集細胞，轉(zhuǎn)移至離心管;加入磷酸鹽緩沖液200 μL，在流式細胞儀上檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)電泳圖

pEGFP－XIAP，pDsRed2－XIAP融合蛋白表達質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ酶切后，可見與XIAP片段大小相符的產(chǎn)物條帶，電泳結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)電泳圖

2.2 激光掃描共聚集顯微鏡圖像

未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合蛋白的HeLa細胞激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，圖像見圖2。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡圖像

由圖2 C可見，轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合蛋白的HeLa細胞呈多邊形，在激光掃描共聚焦顯微鏡下見大量細胞陽性表達，pDsRed2－XIAP融合蛋白彌漫分布于細胞漿和細胞核，在543 nm激發(fā)波長下可見565 nm發(fā)射波長下清晰的紅色熒光。

2.3 轉(zhuǎn)染細胞效率

經(jīng)流式細胞儀檢測，pDsRed2－XIAP融合蛋白在HeLa細胞中的轉(zhuǎn)染率為52.35%。

2.4 HeLa細胞凋亡情況

流式細胞儀檢測結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，米非司酮能誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡，XIAP可抑制由米非司酮誘導(dǎo)的HeLa細胞凋亡。

3 討論

研究宮頸癌Hela細胞內(nèi)抑凋亡因子XIAP的特點以及藥物的干預(yù)作用，將為了解宮頸癌的發(fā)生機制、治療途徑提供基礎(chǔ)。Samuel等[2]通過細胞分級分離試驗(cell fractionation experiments)發(fā)現(xiàn)，XIAP存在于HeLa細胞的胞漿內(nèi)，后來他們利用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)部分HeLa細胞的胞核中也存在XIAP的蛋白表達。XIAP對caspase－3的抑制作用，主要通過結(jié)合caspase－3的底物結(jié)合位點競爭性抑制了caspase－3的活性，可通過BIR1與BIR2之間的接頭域抑制caspase－7的活性，另外還可通過BIR3結(jié)構(gòu)域抑制caspase－9，進而在上游阻止了caspase－3的活性，達到阻斷細胞凋亡的作用[3－6]。XIAP還可以通過NF－κB途徑抑制細胞凋亡，通過上調(diào) XIAP，抑制caspase的激活，從而抑制細胞凋亡[1，7]。

表1 米非司酮藥物處理后HeLa細胞凋亡率的比較(，n=3)

表1 米非司酮藥物處理后HeLa細胞凋亡率的比較(，n=3)

注:與藥物對照組比較，＊P ＜0.05。

組別未處理組空白對照A組空白對照B組藥物對照組試驗A組試驗B組細胞凋亡率(%)0.06 ±0.04＊5.62 ±0.40＊9.29 ±2.45＊46.08 ±2.7348.68 ±0.6126.11 ±0.5＊處理方法未處理轉(zhuǎn)染pDsRed2－N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒米非司酮處理轉(zhuǎn)染pDsRed2－N1質(zhì)粒+米非司酮處理轉(zhuǎn)染pDsRed2－XIAP融合質(zhì)粒+米非司酮處理

本次研究發(fā)現(xiàn)，在米非司酮的誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染XIAP的HeLa細胞凋亡率比轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Hela細胞凋亡率明顯降低，說明XIAP可抑制由米非司酮誘導(dǎo)的HeLa細胞凋亡。筆者認為，XIAP可能通過直接抑制 caspase－3，caspase－6或 caspase－7的激活，抑制 HeLa細胞凋亡;或通過其自身的BIR3，從上游阻斷caspase－9的催化活性，導(dǎo)致細胞凋亡率下降;還可能催化自身及靶蛋白，通過泛素化而降解，并降解與其結(jié)合的caspase[8]，從而增強抑制凋亡活性。

米非司酮的抗腫瘤作用，最初認為主要與其抗孕激素作用有關(guān)。米非司酮通過以下多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用:通過調(diào)節(jié)bcl－2，bax，waf－1等凋亡相關(guān)基因的表達，促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖;誘導(dǎo)細胞分化;通過拮抗藥源性或內(nèi)源性孕激素對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其mRNA的上調(diào)作用，抑制VEGF生成;調(diào)節(jié)細胞周期，將細胞的增殖阻止于G1期;下調(diào)巨噬細胞集落刺激因子受體的表達，抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移;通過調(diào)節(jié)蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)蛋白阻斷神經(jīng)酞胺糖基化，提高腫瘤細胞對相關(guān)化學(xué)治療藥物的敏感性。流行病學(xué)調(diào)查和臨床資料分析顯示，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染與宮頸癌密切相關(guān)。80%的宮頸癌中人乳頭瘤病毒基因組與宿主基因組整合，使E6/E7癌性蛋白過度表達，從而分別使抑癌基因p53/pRb失活，細胞生長失控發(fā)生癌變?；蚰艽龠MHPV－16中E6/E7癌基因的轉(zhuǎn)錄，米非司酮可阻斷孕激素對癌基因的作用，米非司酮還能阻斷人乳頭瘤病毒基因組的整合與轉(zhuǎn)錄[9]。因此米非司酮在宮頸癌的治療中，尤其在阻斷人乳頭瘤病毒基因組與宿主基因組發(fā)生整合的早期宮頸癌變的治療中，將起到重要的作用。米非司酮是唯一應(yīng)用于臨床的孕激素拮抗劑，在藥物人工流產(chǎn)方面已取得滿意療效。為此，將米非司酮作用于人宮頸癌HeLa細胞株，觀察其對HeLa細胞凋亡的作用。試驗結(jié)果顯示，米非司酮能有效誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡。由此可見，米非司酮可望成為臨床上治療宮頸癌的輔助用藥，并且其在HeLa細胞中的作用機制可能與XIAP有關(guān)，但它們具體的結(jié)合方式、作用途徑尚需進一步研究，還可以通過體內(nèi)研究包括動物實驗及臨床研究來進一步探討米非司酮對宮頸癌的治療作用。

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