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    丹紅注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測

    2011-07-28 03:29:56張秀花
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2011年29期
    關(guān)鍵詞:丹紅內(nèi)毒素試劑

    張秀花

    山東省菏澤市藥品檢驗(yàn)所,山東菏澤 274000

    丹紅注射液是由丹參和紅花兩種中藥材經(jīng)化學(xué)提取精制而成的注射液,具有活血化瘀,通脈舒絡(luò)之功效,用于瘀血閉阻所致的胸痹、中風(fēng)、胸痛、胸悶、心悸、口眼歪斜、言語蹇澀、肢體麻木、活動(dòng)不利等癥,并用于冠心病、心絞痛、心肌梗塞、瘀血型肺心病、缺血性腦病、腦血栓等。由于療效顯著,臨床應(yīng)用日趨廣泛[1],為國家重點(diǎn)保護(hù)的中藥品種。作為重點(diǎn)檢驗(yàn)項(xiàng)目之一的安全性評價(jià),目前仍采用家兔法檢查熱原[2]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查具有快速、靈敏、操作簡便、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。為此,特采用此法取代家兔熱原檢查法檢測丹紅注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素,旨在為丹紅注射液的應(yīng)用提供更為科學(xué)的檢測方法。

    1 儀器與試藥

    鱟試劑(湛江博康海洋生物有限公司,批號:1007020,靈敏度0.125 EU/ml;福州新北生化工業(yè)有限公司,批號:10111912,靈敏度0.125 EU/ml),細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(湛江博康海洋生物有限公司,批號:1005050,內(nèi)毒素含量≤0.015 EU/ml),細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所,批號:150601-201072,每支 120 EU),丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司,批號:110164、110174、110172),旋渦混合器(常州國華電器有限公司),TAL-40D型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 丹紅注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)確定

    根據(jù)公式L=K/M,其中,K為每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量,注射劑K=5.0 EU/(kg·h),M為人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量。丹紅注射液臨床最大用量成人為60 ml[2],按成人體重60 kg計(jì)算,代入公式計(jì)算丹紅注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值,L=K/M=5.0/(60/60)=5.0 EU/ml。

    2.2 供試品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)

    市售鱟試劑的靈敏度(λ)在0.5~0.03 EU/ml之間,根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄 “細(xì)菌內(nèi)毒素指導(dǎo)原則”,丹紅注射液的有效稀釋倍數(shù)為10~167倍,本試驗(yàn)采用靈敏度為 0.125 EU/ml的鱟試劑,MVD=L/λ=1×(5.0/0.125)=40倍。

    2.3 鱟試劑靈敏度的復(fù)核

    按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[3],將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(WSE)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)溶解,在旋渦混合器上混合15 min,然后制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ 系列濃度的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每稀釋一步,均在旋渦混合器上混合30 s,每一濃度平行做4管,同時(shí)做2管陰性對照。將試管振搖混合均勻后,置于(37±1)℃試管恒溫儀中 60 min,結(jié)果兩批鱟試劑的靈敏度均在0.5 λ~2.0 λ范圍內(nèi),可用于供試品的干擾試驗(yàn)。見表1。

    表1 鱟試劑靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

    2.4 供試品的干擾初篩試驗(yàn)[4]

    用BET水將丹紅注射液分別稀釋成 40、20、10、5倍的系列濃度,以各稀釋倍數(shù)的樣品將 WSE 制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ系列濃度的供試品內(nèi)毒素溶液,與鱟試劑混合進(jìn)行抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示,供試品原液對鱟試劑有抑制作用,當(dāng)稀釋至5倍時(shí)無干擾作用,3份樣品結(jié)果均相同。見表2。

    表2 供試品的干擾初篩結(jié)果

    2.5 供試品的干擾試驗(yàn)

    根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)結(jié)果[5],最小不干擾濃度為5倍樣品稀釋液。為確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,本試驗(yàn)采用10倍樣品稀釋液進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。用丹紅注射液(BET水10倍稀釋液)將 WSE 稀釋制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ 系列濃度的供試品內(nèi)毒素溶液,每一濃度平行做4管,另取BET水和10倍樣品稀釋液各做兩管陰性對照液,依法操作[6]。結(jié)果表明,Es均在 0.5 λ~2.0 λ 范圍內(nèi),且 Et也均在 0.5 Es~2.0 Es 范圍內(nèi)。說明樣品稀釋10倍后,對鱟試劑無干擾作用。見表3。

    表3 供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果

    2.6 供試品溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測[7]

    根據(jù)干擾試驗(yàn)的結(jié)果和擬定的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度,取樣品3批,分別用BET水稀釋10倍后,采用兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行檢測,結(jié)果均符合規(guī)定。見表4。

    表4 樣品稀釋溶液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果

    3 討論

    參考有關(guān)文獻(xiàn)[8-9],采用兩個(gè)廠家的鱟試劑對3個(gè)批次的樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn),從初篩試驗(yàn)可以看出,丹紅注射液對鱟試劑有干擾作用,當(dāng)樣品稀釋至5倍時(shí),可以排除干擾,確定最小不干擾濃度為5倍樣品稀釋液。為確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠,提高檢測靈敏度,建議實(shí)際操作時(shí)將樣品稀釋10倍或采用更高靈敏度的鱟試劑。此試驗(yàn)說明,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可以代替家兔法用于熱原檢查。

    [1]胡燕,趙亞清,肖峰,等.丹紅注射液治療急性腦梗死隨機(jī)對照試驗(yàn)的Meta分析[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,29(20):1795.

    [2]國家藥品監(jiān)督管理局.國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編[S].內(nèi)科心系分冊,2002:278.

    [3]國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄99.

    [4]鄭霞,趙毓梅,劉春.葛根素注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J].中國藥房,18(16):1254.

    [5]夏振民.藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的限值[J].藥物分析雜志,1995,15(3):54-55.

    [6]陳燕華,徐晉輝.脈絡(luò)寧注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查[J].華西藥學(xué)雜志,2005,20(1):69-70.

    [7]張偉,周繼春.硫酸羅通定注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].2009,10(6):429-432.

    [8]中國生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:310-320.

    [9]梁陳方,李錦燊.凝膠法測定新魚腥草素鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素[J].廣西醫(yī)學(xué),2006,28(11):1775-1776.

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