黃蘑多糖對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及其VEGF表達(dá)的影響

朱惠彬 ，朱順星 ，程 純

1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇南通 226001；3.南通大學(xué)，江蘇南通 226019

目前化學(xué)治療是腫瘤治療中不可缺少的方法之一，然而化學(xué)治療常引起患者免疫系統(tǒng)抑制、感染、胃腸道反應(yīng)等多種并發(fā)癥，甚至加速患者的死亡[1]。環(huán)磷酰胺雖然是臨床常用的化療藥物，但能抑制免疫系統(tǒng)，干擾淋巴細(xì)胞的增殖。所以，抗腫瘤藥物的研究不僅要強(qiáng)調(diào)能有效殺滅瘤細(xì)胞，更要注意積極調(diào)動(dòng)患者自身的免疫功能。黃蘑（huangmo），學(xué)名亞側(cè)耳（hohenbuehelia serotina），俗稱凍蘑、元蘑，為側(cè)耳科側(cè)耳屬的低溫型野生大型食用菌，其多糖是目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。已有研究顯示，黃蘑多糖提取物具有提高免疫力的作用[2]，并能抑制H22、S180、艾氏腹水瘤[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠體內(nèi)移植性肝癌模型，對(duì)黃蘑多糖提取物抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并對(duì)其抗肝癌的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 瘤細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

肝癌H22細(xì)胞株由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。6～8周齡 BALB/c 小鼠 48 只，雌雄各半，體重（20±2）g，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)3 d。

1.2 試劑與儀器

黃蘑多糖提取物（β-D-半乳-葡聚糖苷，分子量35000，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供），環(huán)磷酰胺粉劑（江蘇恒瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H32020857，批號(hào)：09012421），VEGF兔抗小鼠多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司，臨用前用PBS按1∶50稀釋。二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒：GBICO公司），DAB工作液（北京中山生物技術(shù)有限公司），低溫冷凍切片機(jī)（Leica公司），正、倒置顯微鏡（Olympus公司），圖象分析系統(tǒng)（Leica公司），恒溫水浴鍋（Pharmacia公司），電熱恒溫干燥箱（江蘇海門恒昌儀器廠），YJ-875醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），超低溫冰箱（德國(guó)JOUAN公司）。

1.3 模型建立與處理

培養(yǎng)H22細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每只小鼠左腋皮下以5×106個(gè)/ml的瘤細(xì)胞懸液接種0.2 ml，連續(xù)觀察一周，造模成功后將小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，其中，正常組和模型組給予生理鹽水0.2 ml/d，環(huán)磷酰胺組（CTX組）給予環(huán)磷酰胺0.01 g/（kg·d），黃蘑多糖低、中、高劑量組分別給予黃蘑多糖0.02、0.10、0.50 g/（kg·d），給藥體積均為每只 0.2 ml/d，給藥途徑均為灌胃給藥，連續(xù)給藥12 d。

1.4 抑瘤率、免疫指標(biāo)及VEGF組織學(xué)檢測(cè)

停藥次日將小鼠頸椎脫臼處死，稱取體重；眼球取血，以EDTA抗凝，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)目；剝離脾臟、胸腺、瘤塊分別稱重，計(jì)算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和抑瘤率。脾指數(shù)=脾重×103/體重，胸腺指數(shù)=胸腺重×103/體重，按平均瘤重計(jì)算抑瘤率，抑瘤率 （%）=[（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）／模型組平均瘤重]×100%。取瘤組織做冰凍切片免疫組化檢驗(yàn)VEGF的表達(dá)情況。

1.5 染色評(píng)分與VEGF表達(dá)的判定

VEGF陽(yáng)性染色的標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕色顆粒。先在低倍鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況，每例切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，再以200×高倍鏡計(jì)數(shù)，每個(gè)視野取100個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。參考Fromowitz綜合計(jì)分法[4]進(jìn)行染色評(píng)定：總分=陽(yáng)性細(xì)胞比例分值+染色強(qiáng)度分值。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：陰性染色為0分；染色雖弱但明顯強(qiáng)于陰性對(duì)照為1分；染色強(qiáng)度中等為2分；強(qiáng)染色為3分。將兩種評(píng)分相加，結(jié)果分為 4 個(gè)等級(jí)：0～1 分為（-）；2 分為（+）；3～4 分為（++）；5～7分為（+++）。按綜合評(píng)分的等級(jí)來(lái)評(píng)價(jià)各組切片的指標(biāo)變化情況，染色評(píng)分值越高，則對(duì)應(yīng)的VEGF表達(dá)水平越高。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，行方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃蘑多糖的抑瘤作用及對(duì)免疫器官的影響

黃蘑多糖各組的腫瘤重量均低于模型組，其中，中、高劑量組的抑瘤效果顯著（P＜0.05）。CTX組雖然腫瘤重量明顯低于黃蘑多糖各組（P＜0.01），但也顯示了極強(qiáng)的毒副作用，小鼠一般狀態(tài)極差，神情呆滯，行帶遲緩，給藥期間死亡2只。相反，黃蘑多糖各組相對(duì)CTX組，小鼠精神狀態(tài)較好，活動(dòng)較靈活，脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、有核細(xì)胞數(shù)均顯著高于CTX組（P＜0.01），同時(shí)也高于模型組（P＜0.05），顯示了較好的免疫增強(qiáng)作用。見(jiàn)表1、2。

表1 黃蘑多糖對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（）

表1 黃蘑多糖對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 CTX 組比較，#P＜0.05

正常組（n=8）模型組（n=8）CTX 組（n=8）黃蘑多糖低劑量組（n=8）黃蘑多糖中劑量組（n=8）黃蘑多糖高劑量組（n=8）組別 取材時(shí)體重（g）22.6±0.824.8±2.622.0±2.622.4±2.322.0±1.922.7±1.6瘤重（g）02.1±1.50.5±0.2**1.4±1.1#0.9±0.3*0.7±0.8*抑瘤率（%）00.076.233.357.166.7

表2 黃蘑多糖對(duì)H22荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響（）

表2 黃蘑多糖對(duì)H22荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 CTX 組比較，##P＜0.01

正常組（n=8）模型組（n=8）CTX 組（n=8）黃蘑多糖低劑量組（n=8）黃蘑多糖中劑量組（n=8）黃蘑多糖高劑量組（n=8）組別 脾指數(shù)（mg/g）48.9±19.249.4±13.617.0±6.2**55.2±13.8*##55.7±9.1*##56.1±11.0*##胸腺指數(shù)（mg/g）22.4±5.620.4±7.37.5±6.7**21.5±6.5##24.4±3.5*##27.1±6.9*##有核細(xì)胞數(shù)（109/L）2.7±1.02.6±1.41.2±0.2**3.5±1.5*##3.7±1.2*##4.3±0.9*##

2.2 黃蘑多糖對(duì)瘤組織VEGF表達(dá)的影響

黃蘑多糖各組的VEGF表達(dá)率顯著低于模型組（P＜0.01），黃蘑多糖低、中劑量組VEGF的表達(dá)與CTX組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組與CTX組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯示了較強(qiáng)的抗腫瘤血管生成能力。見(jiàn)表3。

表3 黃蘑多糖對(duì)小鼠瘤組織VEGF表達(dá)的影響（，分）

表3 黃蘑多糖對(duì)小鼠瘤組織VEGF表達(dá)的影響（，分）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與 CTX 組比較，#P＜0.05

模型組（n=8）CTX 組（n=8）黃蘑多糖低劑量組（n=8）黃蘑多糖中劑量組（n=8）黃蘑多糖高劑量組（n=8）組別 給藥量（g/kg）-0.010.020.100.50樣本例數(shù) 陽(yáng)性例數(shù)8888888888染色評(píng)分13.2±1.52.9±2.8**5.9±3.4**#4.1±2.8**#3.5±1.7**

3 討論

目前醫(yī)學(xué)界關(guān)于腫瘤的形成發(fā)展有種較成熟的觀點(diǎn)：腫瘤的惡性增殖、轉(zhuǎn)移必須依賴持續(xù)和廣泛的血管生成。而VEGF是腫瘤中主要的血管生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)形成管壁不完整的新生血管，一方面為腫瘤生長(zhǎng)提供血液供應(yīng)；另一方面，不完整的新生血管增加了腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)，在腫瘤發(fā)展中不僅與腫瘤生長(zhǎng)和病理分級(jí)有關(guān)，還影響腫瘤的預(yù)后[5]。肝細(xì)胞癌作為多血管性腫瘤，其生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移均與血管新生有關(guān)，已證實(shí)其VEGF呈高表達(dá)，且VEGF不僅通過(guò)調(diào)節(jié)血管新生促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，還可能直接作用于腫瘤細(xì)胞[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，中草藥的提取成分可以降低瘤組織內(nèi)VEGF的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃蘑多糖對(duì)H22移植性肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且其抗瘤作用與給藥劑量呈一定的量效關(guān)系，同時(shí)黃蘑多糖組的免疫器官重量較CTX組和模型組顯著提高，有核細(xì)胞數(shù)也明顯高于CTX組和模型組（P＜0.01 或 P＜0.05），而馬巖等[8]的研究顯示，黃蘑多糖的提取物對(duì)輔助環(huán)磷酰胺治療腫瘤具有一定的減毒增效作用，其抗瘤效果優(yōu)于單獨(dú)使用CTX或黃蘑多糖。此外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)瘤組織VEGF的表達(dá)情況，證實(shí)黃蘑多糖各組VEGF的表達(dá)顯著低于模型組，并呈一定的濃度依賴性（P＜0.05）。因此，筆者推測(cè)黃蘑多糖的抑瘤效應(yīng)存在多個(gè)作用靶點(diǎn)：①作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫。②抑制腫瘤組織中VEGF的生成，進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，影響腫瘤血管的生成，減少瘤組織血供。③可能存在其他如促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的增殖、干擾細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等途徑。鑒于黃蘑多糖在輔助抗腫瘤治療上具有一定的藥用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

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