高效液相熒光色譜法測(cè)定人血漿中坎地沙坦的質(zhì)量濃度

葉朝清，于翠霞，楊曉紅，朱余兵

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院，江蘇 南京 210006)

坎地沙坦由Astra公司和日本武田株式會(huì)社開發(fā)，1998年7月于瑞典首次上市，是一種選擇性血管緊張素Ⅱ受體(AT)拮抗劑，可阻斷AT1受體，松弛血管平滑肌，增加鹽排泄，抑制細(xì)胞肥大(增生)，降低血壓而不改變心率或心輸出量，阻斷血管神經(jīng)收縮和醛固酮的分泌，從而起到降壓作用[1－2]?？驳厣程归L(zhǎng)期應(yīng)用可逆轉(zhuǎn)左室肥厚，降低左室重量指數(shù)，可治療充血性心力衰竭[3]。本研究旨在建立一種快速、靈敏、專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的高效液相熒光色譜(HPLC－FLU)法，以測(cè)定血漿中坎地沙坦?jié)舛?，并用于坎地沙坦的臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent);超純水儀(美國Millipore);電子天平(Mettler Toledo公司);低溫離心機(jī)(上?？茖W(xué)儀器廠)?？驳厣程箻?biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，純度為98.9%，批號(hào)為100685－200803);空白人血漿，由南京市中心血站提供;甲醇(色譜純，TEDIA公司，批號(hào)為1006908)，超純水(自制)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:BaiAn－C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －0.02 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=4.9，70∶30);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):λex=265 nm，λem=395 nm。在此條件下，坎地沙坦保留時(shí)間為5.5 min，各目標(biāo)化合物峰形良好，能有效分離，無雜峰干擾測(cè)定，基線平穩(wěn)(見圖1)。

2.2 溶液制備

圖1 血漿中坎地沙坦高效液相色譜圖

精密稱取坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.0 g/L的坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密吸取該貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得100 mg/L的坎地沙坦甲醇溶液;依次稀釋，配成質(zhì)量濃度為10 mg/L，1 mg/L，100 μg/L的坎地沙坦甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取磷酸二氫鉀2.72 g，溶于1000 mL超純水中，加磷酸1 mL，搖勻，用三乙胺調(diào)pH為4.9，即得磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀濃度為20 mmol/L)，置4℃冰箱中冷藏備用。

2.3 血樣配制

取離心管數(shù)支，分別精密加入不同量的坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液后，以氮?dú)饬鞔蹈?，加入空白血漿0.5 mL，渦旋1 min，配成分別含坎地沙坦 0，2，5，10，20，50，100，300 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)含藥血樣，同法依次配成血漿中分別含坎地沙坦5，20，250 μg/L的低、中、高質(zhì)控血樣。

2.4 血漿樣品處理

精密加入血漿樣品0.5 mL，置離心管中，加入高氯酸(20%)沉淀液 100 μL，渦旋 1 min，于 16000 r/min離心 5 min。吸取上清液，置自動(dòng)進(jìn)樣分析小瓶中，精密吸取20 μL進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:將系列濃度標(biāo)準(zhǔn)含藥血樣，按2.4項(xiàng)下方法操作，每種質(zhì)量濃度做5份樣品，記錄色譜圖及坎地沙坦峰面積。以坎地沙坦峰面積的平均值(As)對(duì)血藥濃度(C)作回歸計(jì)算，得回歸方程 As=0.1277 C －0.0419，r=0.9984(n=5)。結(jié)果表明，坎地沙坦血漿質(zhì)量濃度在2～300 μg/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，定量下限質(zhì)量濃度為2 μg/L。

回收率及精密度試驗(yàn):取離心管數(shù)支，于離心管中精密加入不同質(zhì)量濃度的坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，以氮?dú)饬鞔蹈珊?，加?.5 mL超純水，渦旋1 min，配成質(zhì)量濃度分別為5，20，250 ng/mL的坎地沙坦溶液，精密加入20%高氯酸沉淀液100 μL，16000 r/min離心5 min，精密吸取上清液30 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積(Ax)。另取離心管數(shù)支，精密加入不同質(zhì)量濃度的坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，以氮?dú)饬鞔蹈珊?，精密加?.5 mL空白血漿，渦旋1 min，配成含坎地沙坦5，20，250 ng/mL的含藥血漿，每種濃度各做5份樣品，按2.4項(xiàng)下操作。記錄色譜圖和峰面積(As)，上述 Ax和 As的比值即為坎地沙坦的絕對(duì)回收率，將 As代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算測(cè)得質(zhì)量濃度和加入質(zhì)量濃度的比值即為相對(duì)回收率，同法可算出批內(nèi)、批間精密度 RSD。結(jié)果見表1。

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5，)

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5，)

回收率(%) 精密度 RSD(%)加入質(zhì)量濃度(μg/L)520250絕對(duì)85.8 ± 6.984.1 ± 3.987.1 ± 3.2相對(duì)97.3 ± 6.390.5 ± 6.495.2 ± 1.0批內(nèi)6.24.01.8批間7.05.62.4

穩(wěn)定性試驗(yàn):取低、中、高3種質(zhì)量濃度質(zhì)控血樣各5份，1份配制好后立即進(jìn)樣分析;另外4份血樣中，1份于室溫放置4 h后提取操作，1份放置4 h并提取后再于4℃放置12 h，1份于冰箱中冷凍保存3周后取出化凍，1份在3周內(nèi)反復(fù)凍融3次，然后測(cè)定。結(jié)果各質(zhì)量濃度血樣測(cè)定值的偏差均小于10%，表明樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求(表2)。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(μg/L)

3 討論

關(guān)于坎地沙坦的含量測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道較多，文獻(xiàn)[4]采用高效液相紫外檢測(cè)法，由于血漿中藥物含量較低，內(nèi)源性物質(zhì)干擾大，難以達(dá)到所需的檢測(cè)靈敏度。文獻(xiàn)[5－7]采用HPLC－FLU法，但樣品處理為鹽酸酸化血漿后，用有機(jī)溶劑提取，甲醇或流動(dòng)相溶解殘?jiān)∩锨逡哼M(jìn)樣分析。此類方法靈敏度雖得到很大提高，但操作過程繁雜，系統(tǒng)誤差大，試驗(yàn)成本較高，同時(shí)有機(jī)溶劑對(duì)操作者毒害大。筆者采用外標(biāo)法，血漿樣品經(jīng)100 μL 20%高氯酸沉淀后，取上清液20 μL進(jìn)樣分析，h該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高，避免了有機(jī)溶劑的毒性和復(fù)雜的操作過程。在對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化的過程中，筆者比較了緩沖液中磷酸鹽的不同濃度、有機(jī)相與水相的不同構(gòu)成比及流動(dòng)相的不同pH對(duì)分析結(jié)果的影響，選擇甲醇－0.02 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖液(70 ∶30，pH=4.9)作流動(dòng)相，在此條件下，坎地沙坦峰形良好，無雜峰干擾測(cè)定，基線平穩(wěn)，樣品分析時(shí)間短(6.5 min)，適合大樣本量的測(cè)試。該方法中，磷酸鹽的濃度不宜很高，避免在使用時(shí)柱平衡和沖洗時(shí)間長(zhǎng)，防止磷酸鹽析出堵塞管路。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法樣品處理簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度較高、重現(xiàn)性好，符合生物樣品分析要求，可用于該藥的生物樣本中含量的測(cè)定和臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。

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