褪黑素對(duì)急性腎臟缺血－再灌注損傷小鼠熱休克蛋白表達(dá)的影響＊

楊紅英，賈孟良 ，謝守霞，黃 毅，謝 立

(1.廣東省深圳市人民醫(yī)院·暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518020;2.廣東省深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

缺血－再灌注損傷是臨床常見(jiàn)的病理現(xiàn)象。急性腎缺血較常見(jiàn)于創(chuàng)傷、休克、敗血癥、產(chǎn)后大出血、腎移植等大手術(shù)后。在腎缺血－再灌注過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生腎小管缺血損傷、壞死等，從而損傷腎小管的功能[1－2]。目前對(duì)腎缺血－再灌注損傷尚無(wú)理想藥物，臨床以營(yíng)養(yǎng)支持、透析等方法治療，等待腎功能恢復(fù)。為尋找抗腎缺血－再灌注損傷藥物，筆者觀察了褪黑素(melatonin)對(duì)腎臟缺血－再灌注損傷的組織結(jié)構(gòu)保護(hù)作用，探討其對(duì)腎臟缺血－再灌注時(shí)熱休克蛋白(HSP70)表達(dá)的影響，試圖了解褪黑素對(duì)腎臟缺血－再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性昆明種小鼠，體重18～22 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為2007A006，試驗(yàn)前常規(guī)飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為屏障環(huán)境(溫度20～25℃，濕度40% ～70%)。褪黑素(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為25H0904，純度大于99%，使用前用3%乙醇生理鹽水溶解)。熱休克蛋白免疫組化(SABC)試劑盒(武漢博士德公司)，其余試劑及有機(jī)溶劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

造模:小鼠腹腔注10%水合氯醛(30 mg/kg)麻醉，固定后，常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)。小鼠腹正中切口，切除右側(cè)腎臟，游離左側(cè)腎臟，用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉左側(cè)腎蒂45 min，去除血管夾，肉眼觀察3 min，若左側(cè)腎臟灌注后顏色由暗黑轉(zhuǎn)為紅潤(rùn)，表示灌注成功，縫合切口，再灌注24 h[3]。

分組與給藥:將小鼠隨機(jī)分為4組，褪黑素高、低劑量組(n=10)，術(shù)前30 min腹腔分別注射褪黑素10 mg/kg和1 mg/kg，夾閉左側(cè)腎蒂缺血45 min，再灌注24 h;缺血－再灌注組(n=10)，術(shù)前30 min腹腔注射與治療量等容量的3%乙醇生理鹽水，夾閉左側(cè)腎蒂缺血45 min，再灌注24 h;假手術(shù)組(n=10)，術(shù)前30 min腹腔注射與治療量等容量的3%乙醇生理鹽水，全身麻醉后只切除右腎，縫合切口。4組均在24 h后取血和腎組織。

腎臟病理檢查:腎組織經(jīng)10%福爾馬林固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片厚4 μm做HE染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管的結(jié)構(gòu)及腎小球內(nèi)中性粒細(xì)胞的數(shù)目。

免疫組化檢測(cè):采用SABC法檢測(cè)腎組織中熱休克蛋白的表達(dá)。將石蠟包埋的腎組織標(biāo)本切成4 μm厚切片，然后按以下步驟進(jìn)行。腎組織石蠟切片脫蠟至水;滴加3%H2O2，室溫放置10 min，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次;熱修復(fù)抗原，切片浸入磷酸鹽緩沖液，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復(fù)1次，冷卻后磷酸鹽緩沖液洗滌2次;滴加工作濃度一抗，37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次;滴加工作濃度二抗，37℃孵育20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次;滴加SABC，37℃放置20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次;3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，呈棕黃色為止，蒸餾水洗滌;蘇木素復(fù)染;脫水、透明、封片。熱休克蛋白陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿呈棕黃色染色，不著色者為陰性反應(yīng)，并采用計(jì)算機(jī)圖像灰度分析，測(cè)定平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)腎小球內(nèi)中性粒細(xì)胞的影響

腎臟組織病理檢查，假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎小球內(nèi)偶見(jiàn)中性粒細(xì)胞;缺血－再灌注組小鼠左腎血流被阻斷45 min后恢復(fù)再灌注24 h，肉眼可見(jiàn)腎皮質(zhì)較蒼白，腎髓質(zhì)呈暗紅色，光鏡下可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)不同程度的變性、壞死，部分腎小管細(xì)胞出現(xiàn)混濁腫脹，管腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型及脫落上皮細(xì)胞，間質(zhì)充血水腫，腎小球內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P＜0.01);褪黑素高、低劑量組小鼠腎臟外觀與假手術(shù)組相似，光鏡下僅見(jiàn)部分腎小管細(xì)胞輕度腫脹，腎缺血性改變明顯減輕，腎小球內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)目較缺血－再灌注組明顯減少(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 褪黑素對(duì)腎缺血－再灌注損傷小鼠腎小球內(nèi)中性粒細(xì)胞和腎組織熱休克蛋白表達(dá)強(qiáng)度的影響()

表1 褪黑素對(duì)腎缺血－再灌注損傷小鼠腎小球內(nèi)中性粒細(xì)胞和腎組織熱休克蛋白表達(dá)強(qiáng)度的影響()

注:與假手術(shù)組相比，＊P＜0.01;與缺血－再灌注組相比，△P＜0.01;▲P ＜0.01。

2.2 對(duì)腎組織熱休克蛋白表達(dá)強(qiáng)度的影響

各組腎組織均有熱休克蛋白的表達(dá)，其中假手術(shù)組腎組織僅有少量熱休克蛋白表達(dá);與假手術(shù)組相比，缺血－再灌注組腎組織熱休克蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.01);與缺血－再灌注組相比，褪黑素高、低劑量組腎組織熱休克蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)。各組腎組織熱休克蛋白表達(dá)強(qiáng)度經(jīng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

圖1 各組熱休克蛋白的表達(dá)情況

3 討論

持久的腎臟缺血將造成不可逆的損傷，盡快恢復(fù)再灌注是治療腎臟缺血的基本保證，但再灌注可能進(jìn)一步加重腎臟細(xì)胞的損傷。缺血－再灌注導(dǎo)致的組織細(xì)胞損傷主要與活性氧自由基產(chǎn)生、膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量消耗、細(xì)胞骨架紊亂等密切相關(guān)。在腎缺血－再灌注損傷過(guò)程中，腎臟在黃嘌呤氧化酶催化下，由次黃嘌呤生成尿酸的過(guò)程中，產(chǎn)生大量的活性氧自由基損傷組織。循環(huán)中的中性粒細(xì)胞與腎血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和隨后的中性粒細(xì)胞激活與浸潤(rùn)，可降低腎小球?yàn)V過(guò)率和腎小管的重吸收，加劇腎缺血－再灌注損傷[2]。

研究顯示，褪黑素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)、最有效的自由基清除劑和抗氧化劑，可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗缺血－再灌注損傷方面保護(hù)作用[4－6]。褪黑素通過(guò)發(fā)揮自身的自由基清除劑作用，以及增加谷胱甘肽(GSH)、減少缺血－再灌注后心肌組織中丙二醛(MDA)產(chǎn)生等抗氧化作用，減少心肌組織細(xì)胞凋亡和壞死，從而減少缺血再灌注后心臟的梗死面積[6]。褪黑素可以降低缺血再灌注后肝組織的氧化損傷程度，減少多形核白細(xì)胞(PMN)的浸潤(rùn)[7]。缺血后使用褪黑素處理可以減少額腦區(qū)的一氧化氮(NO)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)、活化型一氧化氮合酶(iNOS)，同時(shí)減少微血管中黏附因子的生成和附壁白細(xì)胞的數(shù)目，減輕缺血再灌注后組織器官微循環(huán)的無(wú)復(fù)流現(xiàn)象[8]。光鏡觀察結(jié)果表明，褪黑素對(duì)急性腎缺血－再灌注損傷具有保護(hù)作用。

熱休克蛋白在正常細(xì)胞中水平較低，而在應(yīng)激狀態(tài)下顯著升高，在缺血、缺氧等情況下，如局灶及全腦缺血后受損細(xì)胞內(nèi)的變性蛋白可誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)。熱休克蛋白等內(nèi)源性物質(zhì)在腎臟缺血－再灌注損傷中有重要作用，其對(duì)缺血－再灌注腎臟的保護(hù)作用可能與以下機(jī)制有關(guān):抑制腎組織的炎癥反應(yīng)[9];熱休克蛋白發(fā)揮分子伴侶作用穩(wěn)定缺血時(shí)Na+－K+－ATP酶在細(xì)胞骨架上的錨著，穩(wěn)定細(xì)胞骨架[10];減輕Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[11]。

本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，僅有少量熱休克蛋白表達(dá);缺血－再灌注組小鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)不同程度的變性、壞死，熱休克蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著增強(qiáng)，這是由于缺血本身為一種應(yīng)激反應(yīng)，可誘導(dǎo)其表達(dá)，而且也是機(jī)體調(diào)動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用;褪黑素高、低劑量組缺血性改變較缺血再灌注組明顯減輕，接近正常，熱休克蛋白表達(dá)豐富。熱休克蛋白表達(dá)的上調(diào)，可能是褪黑素對(duì)腎缺血細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)熱休克蛋白的表達(dá)，從而使其合成增加，使得腎臟對(duì)缺血及氧化損傷的抵抗能力增加，顯著改善小鼠腎臟缺血－再灌注的損傷。

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