高效液相色譜法測定丹墨膠囊中丹酚酸B含量＊

林生文 ，李瑞明 ，陳 孝 ，隆 穎 ，曹 媛 ，吳敏江 ，任 斌

(1.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180; 2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510080)

丹墨膠囊是由墨旱蓮、女貞子和丹參等組方，具有滋陰補(bǔ)腎、活血祛瘀功效，主要用于治療以腎虛為主的慢性腎炎、隱匿性腎炎和腎病綜合征，可大幅度減少激素用量和副作用，提高療效，推遲復(fù)發(fā)時間，減少復(fù)發(fā)次數(shù)，治療效果顯著[1]。丹酚酸B為方中主藥丹參的主要有效成分，2010年版《中國藥典(一部)》[2]中其含量也是丹參藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。因此，筆者選擇丹酚酸B作為含量測定指標(biāo)，參照文獻(xiàn)[3－6]對丹墨膠囊進(jìn)行含量測定，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

日本島津SIL－HTC高效液相色譜儀;SPD－20A型紫外檢測器，Agilent 1100型高效液相色譜儀;普析通用TU－1901型紫外－可見分光光度計(jì);Sartorius CP225D型電子天平。丹酚酸B對照品(含量 97.2%，中國藥品生物制品檢定所，批號為 110562－200807);甲醇(色譜純)，水為超純水，其他試劑均為分析純;丹墨膠囊(批號為101001，101002，101003，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Ecosil C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－甲醇－甲酸－水(10∶30∶1∶59);流速:1.0 mL/min;紫外檢測波長:286 nm。

2.2 溶液制備

精密稱取丹酚酸B對照品0.01235 g，置20 mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(每1 mL含丹酚酸B 0.060021 mg)。取樣品 0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(300 W，40 kHz)，放冷，稱重，用70%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按處方中藥味比例，根據(jù)丹墨膠囊制備方法制成缺丹參的陰性對照樣品，依供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察:分別精密量取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1，可見本方法具有較高的專屬性，在此條件下所測得的結(jié)果能代表對照品溶液和供試品溶液的含量。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:取丹酚酸B對照品0.01235 g(含量為97.2%)，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液，分別吸取 2，6，10，20，30，40 μL，注入液相色譜儀，依法測定，以對照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=1154094X－4714.17，r=0.99999(n=6)。結(jié)果表明，丹酚酸 B 進(jìn)樣量在 0.120042 ～2.40084μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.5%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份供試品溶液，分別于制備后0，2，4，6，12，24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果含量的 RSD為1.3%(n=6)，表明供試品溶液自制備后24 h內(nèi)測定基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取丹酚酸B對照品適量，加入70%甲醇配成質(zhì)量濃度為214.83 g/L的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)加樣貯備液。精密稱取同一批已知含量(含量3.1959 mg/g)的供試品6份，每份取樣為0.3 g，分別加入上述標(biāo)準(zhǔn)加樣貯備液4，5，6 mL，每個平行2份，按供試品溶液制備方法制成加樣回收樣品溶液，取10 μL進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1，表明該方法回收率良好。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

分別取3批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，依法測定。結(jié)果批號為101001，101002，101003的樣品中丹酚酸 B 平均含量分別為 3.20，3.17，3.11 mg/g，含量均符合規(guī)定。

3 討論

取丹酚酸B對照品適量，加水制成每1 mL含60μg的溶液，用紫外－可見分光光度計(jì)于190～400 nm波長間掃描。結(jié)果在(286±2)nm波長處有最大吸收，與2010年版《中國藥典(一部)》丹參項(xiàng)下測定波長286 nm一致，故選用286 nm為檢測波長。

分別以水、50%甲醇、70%甲醇為提取溶劑處理樣品，結(jié)果各溶劑的提取效果無顯著差異，但70%甲醇提取的雜質(zhì)較少，故選擇70%甲醇進(jìn)行超聲提取，并補(bǔ)足減失的質(zhì)量以滿足精確性要求;同時對70%甲醇的不同提取時間進(jìn)行了比較，結(jié)果不同提取時間的提取效果相差不大，考慮到不同超聲儀器的差異，為了保證樣品提取完全，故選用超聲提取30 min。

經(jīng)方法學(xué)考察，所建立的含量測定方法適用于產(chǎn)品中丹酚酸B的含量測定，方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，精密度好，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

[1]陽 曉，葉任高，劉冠賢，等，38年中西醫(yī)結(jié)合治療腎臟病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(Acad J SUMS)，2000，21(6):401－408.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅥB.

[3]游勇基，陳銘輝.高效液相色譜法測定丹參中丹酚酸B等3種有效成分[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38(12):950－952.

[4]楊廣德，賀浪沖，李永茂.丹參有效部位指紋圖譜定性和有效成分定量分析方法研究[J].藥物分析雜志，2003，23(6):409－413.

[5]呂 東，劉亞蓉.復(fù)方丹參膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究[J].西北藥學(xué)雜志，2000，15(6):254－255.

[6]段曉穎.HPLC測定乳疾寧膠囊中丹酚酸B的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009，26(4):310－312.