紅外光譜法測(cè)定虎舌紅提取物中的總黃酮

凌育趙，劉經(jīng)亮

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520)

虎舌紅(Ardisiamamillata)，又名紅毛氈、寶鼎紅、天仙紅衣、毛涼傘、金絲紅珠等，為紫金?？谱辖鹋賉1]，具有清熱利濕、活血止血、去腐生肌等功效，對(duì)跌打損傷、風(fēng)濕骨痛、肺癆咳嗽、疳積肝炎等均有療效[2]。黃酮類化合物是紫金牛屬植物的主要活性成分之一[3]，用于防治皮膚疾病、增強(qiáng)免疫力和預(yù)防心血管疾病等方面[4]，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等廣泛的生物活性與功效[5]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)虎舌紅活性成分的研究，主要集中在揮發(fā)油、生物堿及多糖類[6～8]，而對(duì)虎舌紅黃酮類成分的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。作者在前期研究的基礎(chǔ)上，采用索氏回流法及溶劑萃取法，成功地提取了虎舌紅中的總黃酮，并以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用紅外光譜儀對(duì)提取物中總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

虎舌紅全草由廣東省農(nóng)科院芳村花卉基地提供，經(jīng)仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物研究室鑒定為紫金?？?Myrsinacese)紫金牛屬(Ardisia)虎舌紅。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；溴化鉀、鹽酸、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、鎂粉等，均為分析純。

IRPrestige21型傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)NICOLET公司；752C型紫外可見分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，蘇州江東精密儀器有限公司；FA-1004型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮公司。

1.2 虎舌紅總黃酮的提取與鑒定

1.2.1 虎舌紅總黃酮的提取

稱取粉碎過篩的虎舌紅粉末20.0 g，置于燒瓶中，加入8 BV 75%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇，于80 ℃下索氏回流提取5次，每次2.5 h。抽濾，收集濾液，減壓回收乙醇溶劑，揮干，濃縮得浸膏0.45 g。用適量熱水溶解浸膏，趁熱過濾除去不溶物，然后加入1/3體積的石油醚(脫脂，并除去部分色素)，振蕩?kù)o置分層；棄去石油醚溶解物，在萃取后的水溶液中加入1/3體積的乙酸乙酯萃取4次，收集乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮去溶劑得總黃酮0.38 g，收率1.90%。

1.2.2 虎舌紅總黃酮的鑒定

(1)HCl-鎂粉反應(yīng)。取上述提取物少許，置于試管中，加75%乙醇 2 mL，在水浴中加熱溶解，滴加濃鹽酸2滴，再加鎂粉約 0.50 g，即發(fā)生劇烈反應(yīng)，生成的泡沫呈明顯紅色，溶液顏色逐漸由黃色變?yōu)槌燃t色。據(jù)此鑒定提取物為黃酮類物質(zhì)。

(2)紅外光譜鑒定。取烘干后的蘆丁少許，加入一定量的溴化鉀，制成固體壓片，用傅立葉變換紅外光譜儀在掃描范圍 4000～400 cm-1、分辨率 4 cm-1、掃描次數(shù)為 4的條件下繪制紅外光譜圖；同法繪制精制虎舌紅提取物的紅外光譜圖，對(duì)比鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 虎舌紅總黃酮的紅外光譜分析(圖1)

A.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 B.虎舌紅提取物

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和虎舌紅提取物的紅外光譜分別在3296.90～3425.78 cm-1左右均出現(xiàn)寬而強(qiáng)的吸收峰，是-OH的伸縮振動(dòng)峰，表明存在酚羥基或糖上的羥基，且數(shù)目較大；在2973.34 cm-1處出現(xiàn)弱吸收峰，是碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)峰，說明飽和碳上的氫較少；在1655.80 cm-1、1662.15 cm-1處出現(xiàn) C=O的伸縮振動(dòng)中強(qiáng)峰，兩者位置和峰型一樣，說明提取物是黃酮類物質(zhì)；在1614.50 cm-1、1505.81 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，是芳環(huán)中C=C的伸縮振動(dòng)吸收峰，也是黃酮的特征吸收峰；在 1093.21 cm-1左右出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰，是C-O的伸縮振動(dòng)峰；在1355.60 cm-1、1143.25 cm-1處出現(xiàn)羥基的彎曲振動(dòng)峰；在 807.28 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)鄰位氫引起的吸收峰；在 1000～600 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)上取代基位置引起的吸收峰，但峰位置不同，說明提取物與蘆丁的羥基取代位置不同；其它位置的吸收峰基本一致。這些表明，提取物中含有羥基、羰基、碳氧單鍵以及不同位置取代的苯環(huán)等官能團(tuán)，特征吸收峰一致。因此可確定提取物是黃酮類化合物。

2.2 紫外可見分光光度法測(cè)定虎舌紅中總黃酮含量

以蘆丁為對(duì)照品，采用NaNO2-AlCl3比色法測(cè)定總黃酮含量[6]。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取40 μg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL于50 mL容量瓶中，加入0.50 mol·L-1NaNO2溶液1.00 mL，搖勻，靜置5 min；加入0.30 mol·L-1AlCl3溶液1.00 mL，搖勻；加入1.00 mol·L-1NaOH溶液5.00 mL、50%乙醇定容至刻度，放置15 min，于410 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A)對(duì)濃度(c)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=0.4275c+0.0003，R=0.9987，蘆丁在0.080～0.400 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.2 含量測(cè)定

取適量樣品溶液，按2.2.1方法測(cè)定吸光度，據(jù)回歸方程計(jì)算得總黃酮含量為19.54 mg·g-1。

2.3 紅外光譜法測(cè)定虎舌紅中總黃酮含量

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

黃酮類化合物4-位大多數(shù)有羰基，這是黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)特征。紅外光譜圖中，在 1662.15～1505.81 cm-1范圍內(nèi)羰基有較強(qiáng)的吸收，其吸收強(qiáng)度與含量有關(guān)，且不易受其它峰的影響，因此選擇羰基峰為定量峰，紅外定量峰面積由兩側(cè)的峰谷確定。

在定量程序中建立標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖，以1662.15～1505.81 cm-1范圍內(nèi)吸光度(A)的面積值作為定量值，用傅立葉變換紅外光譜儀的朗伯-比耳定量程序建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蘆丁質(zhì)量(M，mg)對(duì)峰面積(S)進(jìn)行線性回歸，得到：M=0.0359S-0.3547，相關(guān)系數(shù)為0.9803。本方法的檢出限為0.04 mg。

2.3.2 含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取樣品溶液6份，稱取相應(yīng)的溴化鉀使質(zhì)量總和在0.0850～0.0860 g之間。按2.3.1方法繪制紅外光譜圖，應(yīng)用朗伯-比耳定量程序計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 紅外光譜測(cè)定提取物中總黃酮含量

由表1可知，提取物中總黃酮的平均含量為19.47 mg·g-1。與紫外可見分光光度法測(cè)定結(jié)果基本一致。

2.3.3 吸光系數(shù)K

從紅外光譜圖上得到樣品的吸光度，再根據(jù)固體壓片的厚度計(jì)算吸光系數(shù)K為2.379×103g·cm-1。

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

采用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品(蘆丁)和試樣加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，回收率在93.54%～104.35%之間，平均回收率為98.72%；其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 2.09%(n=6)，說明方法精密度高。

3 結(jié)論

應(yīng)用紅外光譜法測(cè)得虎舌紅中的總黃酮含量為19.47 mg·g-1，與紫外可見分光光度法測(cè)定結(jié)果(19.54 mg·g-1)基本一致。紅外光譜法測(cè)定虎舌紅中總黃酮含量時(shí)吸光系數(shù)達(dá)到 2.379×103g·cm-1，吸光系數(shù)K較小，適合于常量分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.09%(n=6),加標(biāo)回收率為93.54%～104.35%，平均回收率為98.72%。該法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，可用于黃酮類有效成分的質(zhì)量監(jiān)控。

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[3] 姚新生．天然藥物化學(xué)(第二版)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：194.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：629.

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