提取方法和溶劑對(duì)石榴皮中抑菌成分提取的影響

汝紹剛，崔 波，遲玉霞，朱 政，朱慶書，趙文英

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042；2.棗莊職業(yè)學(xué)院，山東 棗莊 277800； 3.山東食品藥品職業(yè)學(xué)院，山東 淄博 255000)

石榴為石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，其根、葉、花、果實(shí)、果皮、種子均可入藥，具有廣泛的藥用價(jià)值。研究表明，石榴所具有的抗癌、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、改善心血管系統(tǒng)等功效主要與石榴皮中所含的鞣質(zhì)類成分有關(guān)[1]。

在中草藥提取研究中，許多先進(jìn)的提取技術(shù)越來(lái)越受到重視。如微波提取法具有耗時(shí)短、對(duì)極性分子的選擇性加熱從而將其選擇性地溶出、受溶劑親和力的限制較小、安全可靠、無(wú)污染等特點(diǎn)[2]；超聲波提取法具有溫度低、耗時(shí)短、效率高、不受中藥材成分性質(zhì)限制、提取液雜質(zhì)少、簡(jiǎn)單易行等特點(diǎn)[3]。

作者采用不同溶劑比較了微波提取法、超聲波提取法、加熱回流提取法對(duì)石榴皮抑菌成分的提取效果，并對(duì)各提取物的抑菌活性進(jìn)行了研究，擬為選擇適宜的提取石榴皮抑菌成分方法提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

石榴皮，購(gòu)于山東棗莊。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)由青島科技大學(xué)藥學(xué)系藥劑實(shí)驗(yàn)室提供；蛋白胨，天津巴斯夫化工有限公司；牛肉膏，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂，青島凍粉廠；氯化鈉及其它試劑均為分析純。

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ-100型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化儀器有限公司；RXZ智能型人工氣候箱，寧波科技園新江南儀器有限公司。

1.2 石榴皮中鞣質(zhì)的提取

1.2.1 微波提取法

取粉碎的石榴皮適量，放入燒杯中，按1∶20(g∶mL，下同)的料液比加入適量溶劑，中低火微波加熱30 s，冷卻一段時(shí)間再繼續(xù)加熱，共加熱提取10 min，過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加水稀釋，用紫外分光光度法測(cè)定其中鞣質(zhì)的含量。

1.2.2 超聲波提取法

取粉碎的石榴皮適量，放入具塞錐形瓶中，按1∶20的料液比加入適量溶劑，浸泡2 h，放入超聲波清洗器中，40 ℃提取30 min后，過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加水稀釋，用紫外分光光度法測(cè)定其中鞣質(zhì)的含量。

1.2.3 加熱回流提取法

取粉碎的石榴皮適量，放入燒瓶中，按1∶20的料液比加入適量溶劑，置水浴上保持微沸，回流提取2 h后，過(guò)濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，加水稀釋，用紫外分光光度法測(cè)定其中鞣質(zhì)的含量。

1.3 抑菌實(shí)驗(yàn)[4]

以牛肉膏蛋白胨作培養(yǎng)基(培養(yǎng)基須在1.05 kg·cm-2、121.3 ℃下滅菌30 min)，在無(wú)菌條件下用滅菌的打孔器在制成的固體培養(yǎng)基平板上打孔，用滅菌的吸管分別吸取配好的樣品溶液，以乙醇為空白，注滿瓊脂孔。將培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)量抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

1.4 鞣質(zhì)含量的測(cè)定[5]

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度；精密量取5 mL，置50 mL棕色瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得0.05 mg·mL-1沒食子酸對(duì)照品溶液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對(duì)照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬酸試液1.0 mL，再分別加水11.5 mL、11.0 mL、10.0 mL、9.0 mL、8.0 mL、7.0 mL，加29% 碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)的試劑為空白，采用紫外分光光度法在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

擬合得到線性回歸方程：y=94.299x+0.0013(R=0.9995)，表明沒食子酸在0.01～0.001 mg·mL-1范圍線性關(guān)系良好。

1.4.3 樣品溶液的制備

精密量取一定體積揮去溶劑的石榴皮提取液，用水稀釋至一定倍數(shù)，搖勻，即得。

1.4.4 鞣質(zhì)含量的測(cè)定

總酚：精密量取樣品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，按1.4.2方法，自“加入磷鉬酸試液1.0 mL”起，加水10 mL，測(cè)定吸光度。

不被吸收的多酚：精密量取樣品溶液25 mL，加至已盛有0.6 g干酪素的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置(30±2) ℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出放冷，濾過(guò)，棄去初濾液；精密吸取續(xù)濾液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按1.4.2方法，自“加入磷鉬酸試液1.0 mL”起，加水10 mL，測(cè)定吸光度。

從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品中沒食子酸的量(mg)，按下式計(jì)算鞣質(zhì)含量：

鞣質(zhì)=總酚-不被吸收的多酚

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法和溶劑對(duì)提取率的影響

分別以水、40%乙醇、60%乙醇、丙酮為溶劑，采用微波提取法、超聲波提取法、加熱回流提取法提取石榴皮中鞣質(zhì)，結(jié)果見表1。

表1 提取方法和溶劑對(duì)石榴皮中鞣質(zhì)提取率的影響

從表1可以看出，3種提取方法的最高提取率相差不大，但最適宜的提取溶劑略有差別。微波提取法和超聲波提取法都在采用丙酮作溶劑時(shí)提取率較高，而加熱回流提取法在采用60%乙醇作溶劑時(shí)提取率較高。這是因?yàn)椋环矫?，微波提取是通過(guò)微波加熱產(chǎn)生熱效應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)提取溶劑溫度迅速升高，液態(tài)溶劑汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，使細(xì)胞外液容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放細(xì)胞內(nèi)有效成分；超聲波提取則需要細(xì)胞內(nèi)的溶劑吸收超聲波能量，然后通過(guò)產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)促使細(xì)胞破裂，使細(xì)胞中的有效成分進(jìn)入溶劑，這兩種提取方法都需要提取溶劑先進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。另一方面，在4種提取溶劑中，丙酮的粘度最小，容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部，通過(guò)微波或超聲波作用使細(xì)胞破裂，因而提取率較高；加熱回流提取主要遵循“相似相溶”原理，由于鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，極性較大，在丙酮中溶解性較小，因而提取率較低。

2.2 提取物抑菌效果比較

將采用不同溶劑、不同提取方法得到的石榴皮提取物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 不同提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果/mm

從表2可以看出，微波提取物和超聲波提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，加熱回流提取物的抑菌效果較差。這可能是因?yàn)?，微波提取法和超聲波提取法的提取時(shí)間短，對(duì)抑菌成分活性破壞小，而加熱回流提取法的提取時(shí)間長(zhǎng)，易使鞣質(zhì)結(jié)構(gòu)中的酚羥基發(fā)生氧化，影響其抑菌效果。

各種提取物的抑菌效果與提取率的高低并不一致：

(1)在微波提取過(guò)程中，以60%乙醇為溶劑時(shí)的提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最好；對(duì)于金黃色葡萄球菌則以丙酮提取物效果最好，但兩者相差不大。綜合考慮提取率與抑菌效果，選擇60%乙醇為微波提取時(shí)的適宜提取溶劑。

(2)在超聲波提取過(guò)程中，對(duì)大腸桿菌來(lái)說(shuō)，60%乙醇和丙酮提取物的抑菌活性基本相同；對(duì)金黃色葡萄球菌來(lái)說(shuō)，60%乙醇和丙酮提取物的抑菌活性也相差不大。因此，選擇60%乙醇為超聲波提取時(shí)的適宜提取溶劑。

(3)在加熱回流提取過(guò)程中，40%乙醇和60%乙醇的提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性基本相同，但從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇40%乙醇為加熱回流提取時(shí)的適宜提取溶劑。

3 結(jié)論

分別以水、40%乙醇、60%乙醇、丙酮4種溶劑，采用微波提取法、超聲波提取法和加熱回流提取法提取石榴皮中的鞣質(zhì)，考察了提取方法和溶劑對(duì)提取率和提取物抑菌效果的影響。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，微波提取法和超聲波提取法的最高提取率與加熱回流提取法相差不大；但從抑菌效果來(lái)看，前兩種提取方法中，60%乙醇提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用更強(qiáng)，并且微波提取法和超聲波提取法相對(duì)于加熱回流提取法具有簡(jiǎn)單易行、耗時(shí)短、操作方便、效率高等特點(diǎn)，適合于中藥提取。

[1] 李云峰，郭長(zhǎng)江，楊繼軍，等.石榴皮抗氧化物質(zhì)的提取及其體外抗氧化作用研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2004，26(2)：143-147.

[2] 陳業(yè)高，海麗娜，畢先鈞.微波輻射在天然藥用活性成分提取分離中的應(yīng)用[J].微波學(xué)報(bào)，2003，19(2)：85-89.

[3] 趙兵，王玉春，歐陽(yáng)藩，等．超聲波在植物提取中的應(yīng)用[J]．中草藥，1999，30(9)：附1-3.

[4] 藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)編寫組.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：117-118.

[5] 王克英，左宏笛，楊理明.紫外分光光度法測(cè)定石榴皮中總鞣質(zhì)含量[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29(6)：66-67.