從RNA酶解液中分離5′-尿苷酸

李德瑩，丁慶豹

(1.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

核苷、核苷酸是構(gòu)成生物遺傳信息DNA和RNA的基礎(chǔ)，在生物細(xì)胞的物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)換中起著重要作用。核酸的分解產(chǎn)物及其衍生物在食品、醫(yī)藥和保健領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1～3]。核苷酸類物質(zhì)的應(yīng)用源于5′-肌苷酸呈鮮味性質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)70年代以來(lái)，核苷酸及其衍生物在抗病毒和抗癌方面受到醫(yī)藥界的普遍重視，現(xiàn)在普遍使用的利巴韋林、齊多夫定、拉米夫定、氟鐵龍等均為核苷酸的衍生物。其中尿苷酸(UMP)參與肝解毒物質(zhì)葡萄糖醛酸酐的生物合成，用于治療肝炎，還可作為生產(chǎn)核酸類藥物、保健食品及生化試劑的中間體，如用于合成尿苷三磷酸(UTP)、聚腺尿、氟鐵龍等藥物。

傳統(tǒng)的UMP制備方法通常是先采用1根陽(yáng)離子交換柱分離4種單核苷酸[4～6]，分別得到UMP、胞苷酸(CMP)、腺苷酸(AMP)的稀溶液和鳥(niǎo)苷酸(GMP)、CMP的混合液；再將UMP調(diào)pH值后，上陰柱分離純化、濃縮。該法存在樹(shù)脂利用率低、4種核苷酸不易完全分離、UMP的質(zhì)量較差、分離周期較長(zhǎng)、環(huán)境溫度較高時(shí)上柱液容易滋生微生物等問(wèn)題；若要進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，還需要增加洗脫液貯罐[7]。肖林平[8]研究了一種新的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，可以將4種核苷酸在該陽(yáng)柱上分離，但各產(chǎn)品色譜峰之間幾乎沒(méi)有距離，導(dǎo)致流出液產(chǎn)品收集存在一定困難。

作者在此采用串聯(lián)的陽(yáng)離子交換柱在酸性條件下首先吸附AMP、CMP和GMP，未經(jīng)吸附的UMP流經(jīng)弱堿性樹(shù)脂柱和強(qiáng)堿性樹(shù)脂柱后，經(jīng)洗脫、濃縮、干燥，得到高純度的UMP。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

麥芽根、酵母RNA，上海線磊生物科技有限公司；001×8、D301、D312、717樹(shù)脂，華東理工大學(xué)華震公司；實(shí)驗(yàn)用試劑均為市售化學(xué)純。

紫外分析儀，752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，超級(jí)恒溫水浴，酸度計(jì)，島津高效液相色譜儀。

1.2 方法

利用麥芽根內(nèi)提取的磷酸二酯酶作用于酵母RNA，可同時(shí)獲得4種5′-單核苷酸，即5′-腺苷酸(AMP)、5′-胞苷酸(CMP)、5′-鳥(niǎo)苷酸(GMP)和5′-尿苷酸(UMP)。AMP、CMP、GMP在pH值1.5時(shí)所帶的正電荷不同，強(qiáng)弱順序依次為AMP>CMP>GMP；UMP因?yàn)闆](méi)有氨基解離，帶負(fù)電荷，從而不被陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附而直接從柱上流出。因此，首先用陽(yáng)離子樹(shù)脂吸附AMP、CMP和GMP，從而將UMP單獨(dú)分離出來(lái)。

1.2.1 磷酸二酯酶的制備[9，10]

稱取100 g麥芽根(金黃色，無(wú)異味，雜質(zhì)少)，加入800 mL去離子水，于室溫(低于25 ℃)浸泡16 h后，置于組織搗碎機(jī)粉碎，用尼龍布擠出浸汁，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酵母RNA的酶解

將200 mL磷酸二酯酶酶液加到2 L 1%的酵母RNA溶液中，于70 ℃攪拌反應(yīng)2 h，反應(yīng)停止后，迅速升溫至90 ℃，加入少量硅藻土、活性炭過(guò)濾，濾液經(jīng)超濾處理。

1.2.3 UMP的分離

采用4柱串聯(lián)的方法。即2根陽(yáng)柱與2根陰柱串聯(lián)，其中1#與2#柱裝填強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001×8、3#柱裝填大孔弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D312、4#柱裝填強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂717。將酵母RNA酶解液依次經(jīng)過(guò)4柱處理后，用2 mol·L-1的HCl調(diào)pH值為1.5。

1.3 分析檢測(cè)

1.3.1 5′-核苷酸的鑒定

1.3.1.1 比值分析

將洗脫液的吸光度比值(A250/A260、A280/A260)與文獻(xiàn)值比較，定性判斷核苷酸種類[11]。4種核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)吸光度比值見(jiàn)表1。

表1 4種核苷酸的吸光度比值

1.3.1.2 瓊脂糖電泳

取適量瓊脂糖水浴加熱溶解，加入pH值3.5的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液，混勻，趁熱吸取3.7 mL鋪在2.5 cm×7.5 cm的白料玻璃板上。冷卻凝固后距一端1.5 cm處開(kāi)一狹縫，注入樣品液，以點(diǎn)樣處為負(fù)極，電壓約300 V，于電泳儀上電泳5 min。將電泳后的瓊脂糖凝膠板移入紫外分析儀中觀察。

1.3.2 5′-核苷酸的純度分析

采用高效液相色譜儀測(cè)定洗脫流出液中4種核苷酸的濃度[12，13]。色譜條件如下：Shim-pack VP-ODS色譜柱(4.6 mm×150 mm)；流動(dòng)相為pH值5.5的0.05 mol·L-1乙酸胺溶液；流速1 mL·min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱壓5.8 MPa。

1.3.3 UMP的收率計(jì)算

2 結(jié)果與討論

2.1 UMP的陽(yáng)柱分離

將1800 mL RNA酶解液按序通過(guò)1#、2#串聯(lián)柱，1#裝柱量為250 mL，2#裝柱量為380 mL，流速約200～250 mL·h-1。檢測(cè)2#柱出口，經(jīng)吸光度比值分析，上樣時(shí)陽(yáng)柱的流出液為UMP；上樣完畢后，陽(yáng)柱中還殘留有少量的UMP，用0.01 mol·L-1的HCl洗柱，流速200～250 mL·h-1。流出曲線如圖1所示。

圖1 UMP流出曲線

由圖1可知，流出液體積約2 L后，260 nm下的吸光度值很小，意味著柱出口處未檢測(cè)到核苷酸。在隨后的繼續(xù)洗脫過(guò)程中，經(jīng)過(guò)一段空白后，2#柱出口處得到GMP。經(jīng)HPLC分析，收集的1.8 L流出液中僅可檢測(cè)出UMP，未檢測(cè)出其它3種核苷酸，這表明使用1.8 L強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可以將UMP與其它核苷酸分離。因此可采用4柱串聯(lián)方式，將殘留在1#、2#、3#柱中的5′-UMP全部洗至4#柱，控制操作條件將AMP保留在1#柱，CMP、GMP保留在2#柱，便于其分離。

2.2 UMP流出液的陰柱純化與濃縮

通過(guò)瓊脂糖電泳分析陽(yáng)柱流出液，發(fā)現(xiàn)在UMP的前端(正極端)仍有兩條明顯的雜質(zhì)帶，說(shuō)明RNA酶解液中含有比UMP帶有更多負(fù)電荷的物質(zhì)，在陽(yáng)柱分離的過(guò)程中，這些物質(zhì)與UMP一起流出。若直接對(duì)UMP流出液進(jìn)行陰離子交換樹(shù)脂濃縮，對(duì)后期UMP的結(jié)晶影響較大，幾乎得不到UMP的結(jié)晶。考慮到主要雜質(zhì)所帶的負(fù)電荷明顯大于UMP，采用弱堿性的大孔陰離子交換樹(shù)脂(3#柱)對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行吸附，并用0.01 mol·L-1HCl洗脫吸附在弱堿性陰離子交換樹(shù)脂上的UMP。經(jīng)此處理，UMP流出液電泳只有一條帶，無(wú)明顯的雜質(zhì)帶，且后期得到晶形非常好的固體UMP。

2.2.1 3#柱樹(shù)脂種類與用量的選擇

3#柱采用大孔弱堿性陰離子交換樹(shù)脂D301，裝柱量為100 mL；4#柱采用強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂717，裝柱量為100 mL。3#柱的作用一方面是對(duì)含有雜質(zhì)的UMP流出液進(jìn)行純化，另一方面是起到調(diào)節(jié)pH值的作用。UMP在pH值較高時(shí)，其磷酸基和烯醇式基團(tuán)均解離帶負(fù)電荷，可被陰離子交換樹(shù)脂所吸附，在pH值2.0～2.5范圍內(nèi)上述基團(tuán)離解度降低。而陽(yáng)柱流出液的pH值為1.0～1.5，此時(shí)UMP是不可能被陰離子交換樹(shù)脂吸附的，但是當(dāng)其通過(guò)大孔陰離子交換樹(shù)脂后，溶液的pH值會(huì)升高到9.0～11.0。因此，3#柱的離子交換樹(shù)脂種類與裝柱量是關(guān)鍵的因素。

當(dāng)3#柱的樹(shù)脂量為100 mL時(shí)，將1800 mL RNA酶解液按序通過(guò)1#、2#、3#、4#串聯(lián)柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4#柱的流出液中UMP漏穿，檢測(cè)漏穿時(shí)3#柱的出口pH值為1.5，說(shuō)明3#柱的樹(shù)脂量偏低。于是將3#柱的樹(shù)脂量增加到150 mL，漏穿現(xiàn)象仍然發(fā)生，此時(shí)，3#、4#柱的出口pH值變化見(jiàn)圖2。

圖2 3#、4#柱的出口pH值(3#柱的樹(shù)脂量為150 mL)

由圖2可見(jiàn)，在流出體積為1600 mL時(shí)，3#柱的出口pH值迅速降到2.5以下，說(shuō)明3#柱的樹(shù)脂量仍然偏低，對(duì)pH值的緩沖能力達(dá)不到要求。

將3#柱的樹(shù)脂量增加到200 mL，并改用交換容量比較大的D312樹(shù)脂，檢測(cè)3#柱出口pH值為8.5，4#柱出口pH值為7.0，流出液中UMP未漏穿，但有部分UMP被吸附到3#柱。采用pH值2.0的稀鹽酸溶液洗滌3#柱，可將UMP全部洗出，而雜質(zhì)全部留在3#柱。3#柱樹(shù)脂種類及用量對(duì)UMP純化的影響見(jiàn)表2。

表2 3#柱樹(shù)脂種類及用量對(duì)UMP純化的影響

由表2可知，采用D312樹(shù)脂，裝柱量為200 mL時(shí)的純化效果最好，UMP收率高達(dá)92.1%。

2.2.2 4#柱洗脫劑的選擇

若4#柱未漏穿，則采用0.01 mol·L-1HCl洗柱，將UMP全部洗至4#柱，然后斷開(kāi)3#柱與4#柱，對(duì)4#柱進(jìn)行洗脫。分別采用0.01 mol·L-1HCl、0.03 mol·L-1HCl作為洗脫劑，發(fā)現(xiàn)洗脫液體積過(guò)大，洗脫液中雜質(zhì)含量較高。改用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl洗脫4#柱，洗脫曲線見(jiàn)圖3。

圖3 4#柱UMP洗脫曲線

洗脫所得到的UMP的吸光度比值與標(biāo)準(zhǔn)品的相比有一些偏差，這可能是因?yàn)橄疵搫┑碾x子強(qiáng)度較高，將一些吸附較牢的雜質(zhì)也洗脫下來(lái)的緣故。因此，降低NaCl濃度至0.2 mol·L-1進(jìn)行洗脫，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 洗脫劑對(duì)UMP純化的影響

由表3可見(jiàn)，用0.01 mol·L-1HCl-0.2 mol·L-1NaCl洗脫下的UMP吸光度比值與用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl的吸光度比值接近，說(shuō)明降低NaCl濃度對(duì)提高其洗脫選擇性并未起到明顯作用，但前者洗脫液總體積為390 mL，相比于后者洗脫液總體積300 mL，增加幅度較大，對(duì)后續(xù)的乙醇結(jié)晶不利。因此，選用0.01 mol·L-1HCl-0.5 mol·L-1NaCl作為洗脫劑，雖然所得溶液中含有雜質(zhì)，但經(jīng)瓊脂糖電泳分析其含量非常少，而且分離后的結(jié)晶也是一個(gè)純化過(guò)程，極少量的雜質(zhì)不會(huì)沉淀出來(lái)。

收集液加入少量糖用活性炭，60 ℃水浴保溫30 min，用砂芯漏斗過(guò)濾，然后調(diào)pH值至7.0～7.5。加入3 BV 95%的乙醇，攪拌、靜置后用無(wú)水乙醇洗滌，真空干燥即得固體UMP，純度達(dá)86%以上。

3 結(jié)論

先采用2根強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換柱串聯(lián)操作，使得AMP保留在1#柱，可以有效解決洗脫液用量過(guò)多、濃度低的問(wèn)題；再采用大孔弱堿性陰離子交換樹(shù)脂，有效去除陽(yáng)柱分離時(shí)上柱流出液中的雜質(zhì)，并自動(dòng)調(diào)節(jié)4#柱的pH值使其有利于UMP吸附；最后直接從4#柱洗脫得到純度較高的UMP，結(jié)晶純度達(dá)86%以上，收率92.1%。縮短了分離周期，節(jié)省了設(shè)備成本。

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