如何建立新藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法

肖貴南，孫清萍，盛英美

廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510180

新藥以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法代替既往的家兔熱原檢查法是一個趨勢，在藥害事件的應(yīng)急處理中有一定的應(yīng)用價值，這也符合國際上對動物實驗的“3R”原則（優(yōu)化、減少、替代）的要求?，F(xiàn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法是1968年美國科學(xué)家Levin和Bang所建立的鱟試驗法[1]。從開展內(nèi)毒素檢查的現(xiàn)狀來看，部分單位未能參照《中國藥典》2010年版二部的要求進(jìn)行實驗和設(shè)計，本文著重介紹在建立新藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中容易出現(xiàn)問題的細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定及干擾試驗這兩個環(huán)節(jié)，力圖為新藥的質(zhì)量控制以及應(yīng)急檢驗提供有益的參考依據(jù)。

1 新藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值的確認(rèn)

1.1 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值的計算公式

新藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值（L）的確定是整個方法學(xué)建立的前提和基礎(chǔ)，現(xiàn)在一般按照《中國藥典》2010版二部附錄XI E進(jìn)行確定[2]。計算公式為L=K/M，K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，非放射性注射劑 K=5 EU/（kg·h），放射性注射劑 K=2.5 EU/（kg·h），鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/（kg·h）；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，成人體重按60 kg計算，體表面積為1.62 m2。部分抗腫瘤藥物及抗生素的使用劑量以體表面積描述時，可將每平方米體表面積劑量乘以0.027，即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量。

1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值的確認(rèn)程序

首先根據(jù)所研究的新藥品種說明書，通過查閱最新版《臨床用藥須知》等相關(guān)權(quán)威資料，得到人用每千克體重每小時的最大供試品劑量（M值）并求出L值，將所求得的L值與相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（《美國藥典》、《英國藥典》、《日本藥局方》、《歐洲藥典》）以及國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)或注冊標(biāo)準(zhǔn)散件中關(guān)于該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素限值進(jìn)行參考對比。

還有一種方法是參考該品種的熱原檢查劑量（可視為M值），因為熱原劑量的設(shè)置一般為成人臨床用量的1～3倍，與常用的安全系數(shù)3～10倍較為接近，這種參考熱原檢查劑量的做法在以前頗為盛行，現(xiàn)在已逐漸少用。

1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素限值計算的常見誤區(qū)

1.3.1 將成人日均用量誤作最大用量 大多數(shù)情況下，說明書或資料往往只提供了某藥的單次或每日用量，實踐中不少人往往將單次用量誤作最大用量進(jìn)行限值計算，所得限值明顯偏寬。眾所周知，除極少數(shù)情況（急性、重癥患者用藥）下的單次用量可作為最大用量外，多數(shù)情況的日常用量換算成最大用量，還需考慮一定的安全系數(shù)（一般取3～10倍）。

1.3.2 誤將每日總用量當(dāng)成每次最大用量 只根據(jù)說明書或資料提供的某藥的每日總用量，未考慮該藥品總量的靜脈滴注時間已經(jīng)遠(yuǎn)不止1 h，這樣求得的限值難于真實反映實際限值，因為M值是反映人用每千克體重每小時能接受的最大供試品劑量，而非全日的總用量。

1.3.3 對于大輸液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定過于按部就班 沒有考慮大輸液的特殊要求，大輸液的主藥成分只占其中很少的一部分，實際多為葡萄糖注射液或生理鹽水注射液，如果按主藥成分計算細(xì)菌內(nèi)毒素限值的話，容易偏寬，因而如無特殊情況一般將熱原檢查劑量10 ml/kg視為最大臨床用量，將大輸液細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為0.5 EU/ml。

1.3.4 忽視滴注時帶入的外源性細(xì)菌內(nèi)毒素 某些新藥在臨床使用時是溶于大輸液進(jìn)行滴注的。假設(shè)某抗生素藥品的規(guī)格是1 g/支，其使用方法是溶于5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h內(nèi)滴注完畢?？蓞⒄障率龇椒ㄓ嬎阍摽股丶?xì)菌內(nèi)毒素限值，此時 K=5 EU/（kg·h），因而 60 kg 的成人每小時體內(nèi)可以接受細(xì)菌內(nèi)毒素的最大量為300 EU，而在1 h內(nèi)250 ml的5%葡萄糖注射液最大可帶來125 EU的細(xì)菌內(nèi)毒素，1 g的該藥最多只能帶入175 EU（125～300 EU）的細(xì)菌內(nèi)毒素，因而該抗生素其細(xì)菌內(nèi)毒素限值可定為0.175 EU/mg。如果按常規(guī)計算的話，求得限值為0.300 EU/mg。

1.3.5 沒有考慮到主藥外的其他成分 在細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定過程中，特別是原料，要注意扣除主藥外的其他成分（如金屬離子：頭孢噻肟鈉中的鈉，西司他丁鈉中的鈉），因為標(biāo)準(zhǔn)一般規(guī)定為每毫克中頭孢噻肟或西司他丁所含的細(xì)菌內(nèi)毒素量不得過多少EU，而制成的原料往往是含鈉等其他成分的。

2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

2.1 前期準(zhǔn)備工作

試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法（如強(qiáng)酸強(qiáng)堿浸泡法），但需經(jīng)過確證不干擾鱟試驗檢查。

2.2 靈敏度復(fù)核試驗

當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。需要注意的是，當(dāng)實測靈敏度 λc 在 0.5λ～2.0λ（包括 0.5λ～2.0λ，λ為鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值）時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度，日常檢驗中部分檢驗者誤將實測的靈敏度作為批鱟試劑的靈敏度來進(jìn)行常規(guī)檢查或干擾試驗。

3 鱟試驗檢查的干擾試驗

3.1 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確認(rèn)

MVD是指在試驗中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)，計算公式為MVD=C·L/λ，式中L為供試品的內(nèi)毒素限值，λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度；C為供試品液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時，則C等于1.0；如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。

此處往往根據(jù)市售主要的鱟試劑靈敏度范圍（0.03～1.00 EU/ml）來計算干擾試驗中的有效濃度稀釋范圍。

3.2 干擾預(yù)試驗

取本品1支（原料精密稱取不低于10 mg的量），按照擬定內(nèi)毒素限值，原料或注射用粉針加內(nèi)毒素檢查用水溶解并稀釋至不超過MVD規(guī)定的系列濃度，注射液直接稀釋至不超過最小有效稀釋濃度的系列濃度，預(yù)試驗時一般可取一個廠家靈敏度為0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鱟試劑，對供試品原液及其系列稀釋液（供試品陰性對照，NPC）進(jìn)行干擾檢驗，另外設(shè)立陽性對照（PC）、陰性對照（NC）、供試品陽性對照（PPC），每個濃度平行做兩管，最終得出供試品（批號：20100802）在某濃度及以下濃度對鱟試驗檢查不產(chǎn)生干擾作用（PPC首次出現(xiàn)“++”的濃度）的結(jié)論。供試液的干擾預(yù)試驗結(jié)果，見表1。

由表1可以看出，供試品在不高于20 mg/ml的濃度下不干擾鱟試驗的檢查。

表1 供試品溶液干擾預(yù)試驗結(jié)果

3.3 正式干擾試驗

按表2制備各系列溶液，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過MVD的溶液，參照鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作，記錄供試液的干擾情況。

表2 凝膠法干擾試驗溶液的制備

只有當(dāng)供試品溶液和陰性對照溶液的平行管都為陰性，且鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列溶液的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時，試驗方為有效，計算系列鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列溶液和干擾試劑系列溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es和 Et）。 當(dāng) Es在 0.5λ～2.0λ 及 Et在 0.5Es～2.0Es時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗。

當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進(jìn)行干擾試驗；當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行干擾試驗。

4 排除供試液干擾的方法[3]

4.1 樣品稀釋法

選用較高靈敏度的鱟試劑，將供試品進(jìn)一步稀釋（低于最大有效稀釋倍數(shù)）后進(jìn)行干擾試驗，一般情況下大部分的干擾作用均能得到有效控制。

4.2 調(diào)節(jié)pH法

測定供試液的pH值，若不在鱟試劑的有效緩沖pH范圍（6.0～8.0），可選用一定濃度的HCl或NaOH將pH值調(diào)節(jié)至6.0～8.0，但要注意應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗證（干擾試驗），確保不干擾鱟試驗檢查，且對內(nèi)毒素檢查結(jié)果無影響。

4.3 超濾法

通過專用超濾系統(tǒng)，將影響內(nèi)毒素檢查的藥物小分子雜質(zhì)濾除，內(nèi)毒素則留存于濾器內(nèi)，濾器內(nèi)加入相應(yīng)的內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行檢查，可在幾乎不影響內(nèi)毒素濃度的前提下盡量避免小分子藥物的干擾作用。

4.4 其他方法

微溫保持加熱法；使用去G因子鱟試劑或廠家提供的專用抗增液對樣品進(jìn)行稀釋（此時須進(jìn)行干擾試驗）。

5 常規(guī)檢查

使用最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液供試品溶液和供試品陽性對照溶液，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的常規(guī)檢測。

6 討論

建立新藥品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，首先要結(jié)合臨床最大用量確定其細(xì)菌內(nèi)毒素限值，應(yīng)用兩個廠家的鱟試劑對3批樣品進(jìn)行鱟試驗檢查（普通凝膠法或動態(tài)濁度法定量試驗），如結(jié)果能證實樣品在不低于最大有效稀釋濃度時對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用，且樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素常規(guī)檢查結(jié)果為陰性，此時方可建立該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[4-7]。

根據(jù)臨床最大用量規(guī)定及實驗結(jié)果，將所研究的新藥細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為每毫克主藥（或每毫升）中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于若干EU。經(jīng)干擾實驗確證，該新藥在某個濃度或低于該濃度時（但不低于最大有效稀釋濃度MVC）對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。取本品3批，按擬定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗，其內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

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