復(fù)方磷酸鹽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

王銀娟，陸 崟，巖林萍，王曙東

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院制劑科，江蘇 南京 210002

磷酸鹽為人體每天必需的無機(jī)鹽，能調(diào)節(jié)維生素D的代謝，維持鈣的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，我院根據(jù)臨床需要率先開發(fā)研制出含有磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉的復(fù)方磷酸鹽注射液，作為成人靜脈營養(yǎng)治療過程中的磷補(bǔ)充劑，用以滿足人體每天對磷的代謝需求。目前，國內(nèi)尚未見復(fù)方磷酸鹽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的報(bào)道。為了更安全有效地控制其質(zhì)量，本文依據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]，對復(fù)方磷酸鹽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行了方法學(xué)研究，以期能為同類制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZH-2自動旋渦混合器 （天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；BET細(xì)菌內(nèi)毒素檢查儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用器具均經(jīng)250℃干烤1 h以上去除熱原，放冷使用。

1.2 試藥

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 （CSE）（中國藥品生物制品檢定所，批號：150601-200963，規(guī)格：120 EU/支）；鱟試劑（TAL，λ=0.5 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司，批號：0904172、0912181；湛江博康海洋生物有限公司，批號：0903113、0912260）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 （WBET，湛江安度斯生物有限公司，批號：0908280，規(guī)格：50 ml/支）。復(fù)方磷酸鹽注射液 （自制，批號：100204、100523、100613，規(guī)格：10 ml/支，家兔熱原檢查合格）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定[2]

根據(jù)公式：細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）=K/M。依據(jù)藥品使用說明書，成人每次用量為1支（10 ml），將本品加入5%或10%葡萄糖注射液500 ml中進(jìn)行輸注，在2 h內(nèi)緩慢輸注完畢。公式中，M為人用每公斤體重每小時(shí)最大劑量，中國人均體重按 60 kg 計(jì)， 則 M=10 ml/（60 kg·2 h）=0.0833 ml/（kg·h），K為人用每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，靜脈給藥時(shí) K=5.0 EU/（kg·h）， 則 L=5.0 EU/（kg·h）/0.0833 ml/（kg·h）=60 EU/ml。考慮到臨床聯(lián)合用藥的安全性和細(xì)菌內(nèi)毒素的累加性[3-4]，在上述計(jì)算限值基礎(chǔ)上將限值要求提高10倍，由此確定復(fù)方磷酸鹽注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值為6 EU/ml。

2.2 鱟試劑靈敏度（λ）復(fù)核

按照《中國藥典》2010年版二部鱟試劑“靈敏度復(fù)核”項(xiàng)下對2個(gè)廠家的TAL進(jìn)行復(fù)核，λc在0.5λ～2.0λ之間，均符合規(guī)定。其中陽性指形成凝膠且倒置不變形滑落，陰性指指未形成凝膠或形成凝膠但倒置后變形滑落。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果，見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

2.3 供試品的干擾試驗(yàn)

2.3.1 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定 按公式MVD=CL/λ，式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，λ為測試用鱟試劑的靈敏度標(biāo)示值，C表示供試品的濃度，目前市售鱟試劑λ通常在 0.50～0.03 EU/ml之間，對應(yīng)的有效稀釋倍數(shù)為 12、24、48、100、200。

2.3.2 干擾預(yù)試驗(yàn) 取復(fù)方磷酸鹽注射液原液，并用WBET分別將其稀釋 6、12、24、48、100、200 倍制成溶液， 作為供試品溶液（NPC）系列。另制備具有相同濃度的供試液，且每一濃度的供試液中均含2 λ內(nèi)毒素濃度（1 EU/ml）的供試液，作為供試品陽性（PPC）系列。取2個(gè)廠家的TAL（λ為0.5 EU/ml）分別與上述NPC、PPC系列反應(yīng)，每一濃度重復(fù)2次，并按常規(guī)設(shè)陽性管（PC）和陰性管（NC）對照。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方磷酸鹽注射液原液對鱟試劑凝集反應(yīng)不存在干擾現(xiàn)象。見表2。

表2 復(fù)方磷酸鹽注射液的干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 正式干擾試驗(yàn) 為了最終確認(rèn)復(fù)方磷酸鹽注射液原液對鱟試劑凝集反應(yīng)是否存在干擾，將供試品原液和WBET分別將CSE制成含內(nèi)毒素濃度為1.000、0.500、0.250、0.125EU/ml的系列溶液（分別為PPC系列和NPC系列），與2個(gè)廠家共4個(gè)批號的TAL（λ均為0.5 EU/ml）反應(yīng)，每一濃度平行4管，并設(shè)陰性對照（NC）。正式干擾試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 復(fù)方磷酸鹽注射液的干擾試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，2個(gè)廠家4個(gè)批號的TAL結(jié)果Es均在0.5λ～2.0λ 范圍內(nèi)，Et均在 0.5Es～2.0Es之間，符合《中國藥典》2010年版（二部）附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的規(guī)定。由此確定復(fù)方磷酸鹽注射液原液為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中無干擾的最小有效稀釋倍數(shù)。

2.4 復(fù)方磷酸鹽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批經(jīng)熱原檢查合格的復(fù)方磷酸鹽注射液原液，使用靈敏度為0.5 EU/ml的2個(gè)不同廠家的鱟試劑，按《中華人民共和國藥典》2010年版（二部）附錄XI E規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠限量檢查法對樣品分別進(jìn)行檢測。復(fù)方磷酸鹽注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果，見表4。

表4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

綜上所述，3批復(fù)方磷酸鹽注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量均小于6 EU/ml。結(jié)果提示，復(fù)方磷酸鹽注射液原液對鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素凝集反應(yīng)無干擾作用，可適用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素限值標(biāo)準(zhǔn)要求定太高可能會使很多批次不能通過檢查，從而造成浪費(fèi)；標(biāo)準(zhǔn)要求定太低則不能保證藥品質(zhì)量，危及臨床用藥安全，所以細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定需結(jié)合臨床用藥實(shí)際，要具合理性。

對復(fù)方磷酸鹽注射液樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，可以在MVD范圍之內(nèi)，即小于MVD的倍數(shù)下進(jìn)行試驗(yàn)，從而減少污染環(huán)節(jié)，使操作更為便捷、經(jīng)濟(jì)。如果供試品溶液在以不超過MVD的某個(gè)稀釋倍數(shù)稀釋，檢測結(jié)果為陽性時(shí)，可對供試品溶液進(jìn)行進(jìn)一步稀釋但不能超過MVD，再重新進(jìn)行試驗(yàn)。

復(fù)方磷酸鹽注射液原液對鱟試劑凝集反應(yīng)無干擾作用，可采用《中國藥典》2010年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，用靈敏度為0.5 EU/ml的鱟試劑對復(fù)方磷酸鹽注射液進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，本法操作簡單，靈敏快捷、實(shí)用性強(qiáng)，并經(jīng)我院多年臨床使用驗(yàn)證，該方法安全可靠，可用于復(fù)方磷酸鹽注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄XI85-88.

[2]王海燕.從細(xì)菌內(nèi)毒素累加的性質(zhì)看全面質(zhì)量管理[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2007,45(13):102-103.

[3]李楚云,陳健紅,詹云麗.開展藥學(xué)服務(wù)控制輸液熱源反應(yīng)[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010,4(6):218-219.

[4]鄭霞,趙毓梅,劉春.鹽酸卡尼地平葡萄糖注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J].中國藥房,2008,19(1):56-57.