正交實驗法研究山楂提取物對α-淀粉酶活性的影響

陳木洲 ，鄒 萍 ，彭國平 ，楊 華

1.廣東眾生藥業(yè)股份有限公司，廣東 東莞 523325；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128

山楂是一種能夠消食導(dǎo)滯的中藥材，對消肉食積滯作用更好，除含有大量有機酸外，還有60余種黃酮類化合物：芹菜素、山奈酚類、木犀草素、槲皮素類及二氫黃酮類等[1-3]，α-淀粉酶能促進多糖物質(zhì)的消化吸收，二者配合能夠獲得效果更好的消食效果[4]。本文旨在研究山楂提取物對消食藥物α-淀粉酶的活性影響，以期獲得一個合適的山楂提取物添加量和山楂提取物與α-淀粉酶復(fù)合消食制劑配制條件。

1 儀器與材料

山楂 （市售），α-淀粉酶 （湖南尤特爾生化有限公司提供），60%乙醇溶液 （V/V）， 蒸餾水，3，5-二硝基水楊酸試劑（取3，5-二硝基水楊酸1.0 g，溶于20 ml的1 mol/L氫氧化鈉中，加入50 ml蒸餾水，再加入30 g酒石酸鉀鈉），麥芽糖，淀粉，pH梯度緩沖溶液 （用0.2 mol/L Na2HPO4與0.1 mol/L檸檬酸按比例配制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 山楂提取物的提取

2.1.1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 應(yīng)用DNS法[5-6]以光密度值OD為縱坐標(biāo)（Y），麥芽糖含量為橫坐（X）標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7.6641X-0.0573，r=0.9935，線性關(guān)系良好。

2.1.2 山楂提取物的提取 準(zhǔn)確稱取2 g山楂粗粉，用12倍量60%的乙醇在90℃下各回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過濾，濃縮干燥，得到山楂提取物。

2.2 山楂提取物對α-淀粉酶促反應(yīng)影響的單因素試驗

2.2.1 山楂提取物濃度對α-淀粉酶活性的影響 將山楂提取物用10倍稀釋法稀釋成濃度依次為0.1000、0.0100、0.0010、0.0001、0.00001、0 mg/ml溶液，在試管中按表1條件依次加入試劑，并加入不同稀釋梯度的山楂提取物0.2 ml進行反應(yīng)，同時以0.2 ml蒸餾水取代山楂提取物在相同條件下進行酶促反應(yīng)作為空白對照，每個反應(yīng)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，在山楂提取物濃度為 0.1000、0.0100、0.0010、0.0001、0.00001、0 mg/ml時 α-淀粉酶活性分別為 （608.43±2.70）、（514.33±3.44）、（489.37±2.38）、（458.75±4.51）、（439.27±3.24）、（437.36±3.68） mg/（g·5 min），表明加入的山楂提取物對 α-淀粉酶活力有明顯的促進作用，且隨著山楂提取物濃度的降低，促進作用減弱，山楂提取物對α-淀粉酶活性最適濃度為0.1 mg/ml。

2.2.2 溫度對山楂提取物存在下α-淀粉酶活性的影響 按照表1的條件，加入濃度為0.1 mg/ml的山楂提取物，pH為6.0，酶促反應(yīng)溫度分別控制為 25、30、40、50、60℃，考察山楂提取物存在下不同溫度條件對α-淀粉酶酶促反應(yīng)的影響，每個溫度條件重復(fù)3次，結(jié)果取均值。結(jié)果顯示，在以上溫度下α-淀粉酶活性分別為 （582.14±6.31）、（603.56±4.58）、（678.87±7.49）、（545.43±8.55）、（610.33±5.56） mg/（g·5 min），結(jié)果表明在山楂提取物存在下α-淀粉酶活性最高的溫度為40℃。

表1 酶促反應(yīng)條件表（ml）

2.2.3 pH大小對山楂提取物存在下α-淀粉酶活性的影響 按照表1的條件，加入濃度為0.1 mg/ml的山楂提取物，反應(yīng)溫度為 60℃，分別用 pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的緩沖液配制酶液和山楂提取物，考察山楂提取物存在下不同pH條件對α-淀粉酶酶促反應(yīng)的影響，每個pH條件重復(fù)3次，結(jié)果取均值。結(jié)果顯示，在以上pH條件下α-淀粉酶活性分別為（175.62±4.24）、（581.33±3.75）、（620.12±1.36）、（539.57±7.61）、（675.72±2.82） mg/（g·5 min），表明 α-淀粉酶作用的最適 pH 為 7.0。

2.3 山楂提取物對α-淀粉酶促反應(yīng)影響的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照表2設(shè)計正交實驗因素水平表，摸索最佳酶促條件。正交實驗結(jié)果，見表3。

表2 正交試驗因素水平設(shè)計

由表3可知，影響酶活的因素重要性依次為pH＞山楂提取物濃度＞溫度。促進α-淀粉酶活力的最佳組合為A2B1C1，即pH為6.8，溫度為40℃，加入稀釋5倍的山楂提取物，即相當(dāng)于加入生山楂量∶α-淀粉酶=88.900∶0.001，α-淀粉酶活力最高。

按照A2B1C1條件進行驗證試驗，平行3次，酶活力分別為687.521、685.241、688.275 mg/（g·5 min），平均酶活力 為687.021 mg/（g·5 min），證明酶促反應(yīng)實驗的重復(fù)性好，酶活力高。

3 討論

由于被動大量攝入谷物類、高蛋白類食物所致的食物結(jié)構(gòu)不合理現(xiàn)象在嬰幼兒中顯得很突出，導(dǎo)致消化不良現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，由此引發(fā)了一系列的消化道疾病，因此，如果以消肉食的山楂和消化谷物類的α-淀粉酶制備成復(fù)合消化劑，可以同時解決蛋白質(zhì)和淀粉類食物的消化不良問題。

作為生物催化劑的α-淀粉酶的活性受到很多因素的影響，其中最大的影響是pH值。添加了山楂提取物后，對其合適添加量的確定及溫度也很重要。正交試驗優(yōu)化了這三個因素的影響。Ga2+對α-淀粉酶活性具有促進作用，本實驗中對Ga2+濃度進行了試驗，發(fā)現(xiàn)Ga2+濃度的變化不是主導(dǎo)因素。通過合理的工藝設(shè)計，可以將本實驗中優(yōu)化的配方與條件進行規(guī)?；a(chǎn)。

表3 正交試驗結(jié)果直觀分析表

本實驗得到的最優(yōu)條件是將山楂用12倍量60%的乙醇在90℃下回流提取2次，每次1 h，將濾液減壓濃縮干燥既得山楂提取物；山楂提取物與α-淀粉酶的復(fù)合制劑配方為pH為6.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液溶解酶，溫度不超過40℃，山楂提取物添加量為20%濃度，此配方可以制備成服用方便的口服液。

[1]董英杰,張乃先,張明磊,等.大果山楂葉黃酮成分研究[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,1996,13(1):31-33.

[2]張培成,徐綏緒.山楂葉化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報,2001,36(10):754-757.

[3]英錫相,李紹維,林延會,等.山楂葉植物學(xué)及化學(xué)成分研究近況[J].遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2001,3(2):98-99.

[4]王慧超,陳今朝,韓宗先.α-淀粉酶的研究與應(yīng)用[J].重慶工商大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2010,27(4):368-372.

[5]田芳年,馬連榮,莫肖云,等.DNS法測定紅棗總糖含量[J].化工技術(shù)與開發(fā),2009,38(9):45-47.

[6]宋陽,王亞瓊,趙麗戀,等.基于淀粉酶活性檢測的麥芽質(zhì)量評價方法[J].藥學(xué)進展,2010,34(9):411-417.