GnRH拮抗劑和激動(dòng)劑聯(lián)合應(yīng)用對環(huán)磷酰胺化療中卵巢功能保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

李友生，陳江鴻

1.武漢市新洲區(qū)中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430400；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣西 柳州 545005

化療是腫瘤治療中的重要手段之一，因其療效確切，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。但由于化療藥物缺乏選擇性，對正常組織細(xì)胞也存在毒性作用。因此，環(huán)磷酰胺化療過程中可引起致卵巢損害導(dǎo)致卵巢功能不全、不孕及早絕經(jīng)，甚至出現(xiàn)卵巢功能早衰（POF），嚴(yán)重影響了年輕女性腫瘤患者的生活質(zhì)量[1]。目前研究表明，GnRH-ant與GnRH-a對化療引起的卵巢損害均具有保護(hù)作用[2-3]，但前者會(huì)導(dǎo)致雌激素一過性升高，后者會(huì)出現(xiàn)低雌激素效應(yīng)，故單用均存在一定的局限性。本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討GnRH-ant與GnRH-a聯(lián)合應(yīng)用化療中卵巢功能的保護(hù)作用及可能的機(jī)制，為其在臨床上的應(yīng)用尋求理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

8～9 周成年雌性 Balb/c 小鼠，體重（20±2）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，以無特殊病原體（SPF）級鼠飼料和凈化水喂養(yǎng)，室溫22℃左右，相對濕度50%左右，明暗交替各12 h。于飼養(yǎng)1周后，每天陰道分泌物涂片觀察性周期，將有正常性周期的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。CTX購于錦州九泰藥業(yè)有限責(zé)任公司，GnRH-ant購自瑞士雪蘭諾制藥有限公司，GnRH-a購自天津博福-益普生制藥有限公司。

1.2 方法

將納入實(shí)驗(yàn)組的36只小鼠隨機(jī)分成4組，A組為對照組，B組為 CTX組，C組為 GnRH-ant+GnRH-a組，D組為GnRH-ant+GnRH-a+CTX組，每組各9只。A組：生理鹽水1 ml/d，連續(xù)腹腔注射20 d；B組：生理鹽水1 ml/d，連續(xù)腹腔注射 10 d 后，給予 CTX 2.0 mg/（kg·d），連續(xù)腹腔注射 10 d；C 組：GnRH-ant 0.5 mg/（kg·d），GnRH-a 0.1 mg/（kg·d），連續(xù)皮下注射 20 d；D組：GnRH-ant與 GnRH-a連續(xù)給藥 10 d后，給予GnRH-ant、GnRH-a與CTX連用10 d。給藥期間，每天將陰道分泌物涂片以觀察性周期。用藥結(jié)束后于動(dòng)情期處死小鼠，取其子宮及雙側(cè)卵巢，稱取濕重后用4%多聚甲醛固定。

1.3 激素測定方法

采用放射免疫法測定小鼠血清中促卵泡生成素（FSH）、雌二醇（E2）的水平，試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或成組資料單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠用藥前后體重變化

用藥前，各組小鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.07，P＞0.05），用藥后B組小鼠體重、子宮及卵巢濕重與其他三組比較顯著減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而C、D組與A組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1、2。

表1 各組小鼠用藥前后體重變化比較（，g）

表1 各組小鼠用藥前后體重變化比較（，g）

注：與 B 組比較，t=5.37，①P＜0.05，t=4.26，②P＜0.05，t=5.58，③P＜0.05；與A 組比較，t=0.70，④P＞0.05；t=0.12，⑤P＞0.05

組別 例數(shù)A組B組C組D組9999用藥前18.35±1.4317.89±1.2717.68±1.0318.52±1.59用藥后19.44±1.52①16.23±0.9518.92±1.64②④19.36±1.39③⑤

表2 各組小鼠子宮及卵巢濕重比較（，mg）

表2 各組小鼠子宮及卵巢濕重比較（，mg）

注：與 B 組比較，t=19.00，①P＜0.05，t=17.36，②P＜0.05，t=18.28，③P＜0.05； 與 A 組比較，t=0.32， ④P＞0.05，t=0.25， ⑤P＞0.05。 與 B 組比較，t=34.00，aP＜0.05，t=29.06，bP＜0.05，t=26.30，cP＜0.05；與 A 組比較，t=0.37，dP＞0.05；t=0.29，eP＞0.05

組別 例數(shù)A組B組C組D組9999子宮濕重68.75±9.41①9.03±0.5467.28±10.05②④67.63±9.60③⑤卵巢濕重18.94±0.53a 8.28±0.7618.03±0.66bd 17.52±0.73ce

2.2 各組小鼠各級卵泡數(shù)量變化

用藥后B組小鼠各級卵泡數(shù)均有所減少，尤其是生長卵泡、成熟卵泡及卵泡總數(shù)，與其他三組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），而C組生長卵泡與成熟卵泡數(shù)較A組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 各組小鼠子宮及卵巢濕重比較（，個(gè)）

表3 各組小鼠子宮及卵巢濕重比較（，個(gè)）

注：初級卵泡，a經(jīng)t檢驗(yàn)，與其他三組比較，tA=20.60、tC=8.46、tD=5.02，P＜0.05；生長卵泡，b 經(jīng) t檢驗(yàn)，與其他三組比較，tB=13.50、tC=23.14、tD=23.86；成熟卵泡，c經(jīng)t檢驗(yàn)，與其他三組比較，tB=14.25、tC=12.16、tD=11.74；卵泡總數(shù)，d經(jīng)t檢驗(yàn)，與其他三組比較，tA=21.29、tC=21.36、tD=21.90；與 A 組比較，t=23.14，①P＜0.05，t=12.16，②P＜0.05

組別 例數(shù) 初級卵泡A組B組C組D組9999665.86±29.42349.45±35.47a 787.47±31.51743.25±35.64生長卵泡218.34±16.49b 124.58±12.7378.25±7.62①69.97±8.73成熟卵泡66.53±8.41c 23.23±3.5228.45±4.19②28.98±4.62卵泡總數(shù)818.23±42.33438.84±32.67d 858.94±49.12797.37±36.67

2.3 各組小鼠血清FSH和E2濃度

用藥后B組小鼠血清FSH水平升高，E2水平下降，與其他三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而C、D組與A組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 4。

表4 各組小鼠用藥前后生殖激素水平比較（）

表4 各組小鼠用藥前后生殖激素水平比較（）

注：與 B 組比較，t=9.23，①P＜0.05，t=6.59，②P＜0.05，t=6.67，③P＜0.05；與A 組比較，t=1.45，④P＞0.05，t=1.87，⑤P＞0.05；與 B 組比較，t=9.23，aP＜0.05，t=6.59，bP＜0.05，t=6.67，cP＜0.05； 與 A 組比較，t=1.90，dP＞0.05，t=1.95，eP＞0.05

組別 例數(shù)A組B組C組D組9999 FSH（IU/L）1.05±0.13①1.89±0.241.28±0.14②④1.32±0.09③⑤E2（pg/ml）49.45±1.58a 36.40±1.9250.93±1.73bd 51.07±1.92ce

3 討論

化療藥物造成卵巢功能損傷的機(jī)制目前尚未完全清楚，通常認(rèn)為，該類藥物影響卵泡的生長發(fā)育與成熟過程，使卵泡受到破壞，卵泡總數(shù)下降，最終導(dǎo)致POF。CTX是臨床上常用的抗腫瘤藥，具有廣譜、強(qiáng)效且無交叉耐藥等特點(diǎn)，但同樣對卵巢功能具有損傷作用。研究表明，GnRH-ant和GnRH-a可通過對促性腺功能的抑制達(dá)到保護(hù)卵巢功能的作用，但是其作用機(jī)制不同，前者可能為抑制性腺軸，阻止原始卵泡向成熟卵泡轉(zhuǎn)變并處于藥物低敏感狀態(tài)[4]，后者主要通過與垂體受體的高度親和，直接抑制內(nèi)源性GnRH的作用[5]。

3.1 GnRH-ant和GnRH-a對生殖器官的影響

用藥后CTX組小鼠體重、子宮與卵巢濕重較其他三組明顯減輕，卵泡總數(shù)顯著減少，尤其是生長卵泡與成熟卵泡，可能原因是CTX加速卵泡閉鎖，過度凋亡，最終導(dǎo)致各級卵泡數(shù)量減少，子宮體積縮小，腺體萎縮和減少。CTX+GnRH-a+GnRH-ant組與GnRH-ant+GnRH-a組體重、子宮與卵巢濕重略低于對照組，而生長卵泡與成熟卵泡顯著減少，初級卵泡與卵泡總數(shù)略高于對照組，提示GnRH-ant和GnRH-a聯(lián)合應(yīng)用可阻止初級卵泡的成熟，不損害靜止期的卵泡，降低CTX對卵巢卵泡的敏感性，從而保護(hù)卵巢的儲(chǔ)備功能[6-7]。

3.2 GnRH-ant和GnRH-a對血清FSH與E2的影響

FSH與E2的水平可作為卵巢儲(chǔ)備功能的間接指標(biāo)[8]。本研究結(jié)果顯示，在CTX組小鼠中，F(xiàn)SH濃度顯著升高，E2水平顯著下降，可能是CTX對損傷卵巢顆粒細(xì)胞，使其無法分泌雌激素，進(jìn)一步干擾下丘腦-垂體-卵巢軸，導(dǎo)致E2水平下降，F(xiàn)SH繼發(fā)性升高。CTX+GnRH-a+GnRH-ant組與GnRH-ant+GnRH-a組小鼠中，血清FSH和E2水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明聯(lián)合應(yīng)用GnRH類似物可有效降低CTX對卵巢儲(chǔ)備功能的損傷。其可能原因是GnRH-ant與競爭性抑制內(nèi)源性GnRH對垂體的興奮作用有關(guān)；GnRH-a使垂體性腺軸受抑制，阻止原始卵泡募集，形成低雌激素水平，而雌激素可抑制顆粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)卵巢的目的。

綜上所述，GnRH-ant和GnRH-a聯(lián)合應(yīng)用克服了單用GnRH-ant所致低雌激素狀態(tài)及單用GnRH-a所致的垂體短暫的興奮作用，優(yōu)勢互補(bǔ)，對化療藥物誘導(dǎo)的卵巢損傷具有一定保護(hù)作用，但其長期有效性與安全性仍需進(jìn)一步臨床觀察。

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