堿性成纖維細胞生長因子對體外培養(yǎng)人牙髓細胞遷移和堿性磷酸酶活性的影響

汪 敏，李 橋，潘乙懷

(浙江 溫州 325000:1.溫州醫(yī)學院;2.溫州醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院)

近年來的研究表明:在牙髓組織的修復再生過程中，多種生長因子相互作用構成功能性網絡，作為始動信號啟動修復的過程。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種肝素粘合多肽，廣泛存在于人體組織中，目前認為bFGF具有促進創(chuàng)傷組織愈合、軟硬組織修復的功能［1］。bFGF與牙髓牙本質復合體損傷后修復的相關作用研究越來越受重視。本研究旨在通過體外培養(yǎng)人牙髓細胞，探討bFGF對牙髓細胞的遷移和堿性磷酸酶活性的影響，為將其應用于牙髓組織的修復再生提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要儀器設備和試劑

二氧化碳恒溫孵箱(Thermo公司，美國);超凈工作臺(上海凈化設備有限公司);生物倒置相差顯微鏡、體視顯微鏡和光源(Nikon公司，日本);高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國);標準型胎牛血清(FBS，Gibco公司，美國);bFGF(PeproTech公司，美國);Transwell培養(yǎng)小室(Millipore公司，美國);ALP試劑盒(南京建成)。

1.2 人牙髓細胞的體外培養(yǎng)

取因正畸或阻生拔除的健康恒牙(均無齲損、根尖周炎和牙周炎 )，嚴格無菌下獲取牙髓，無血清DMEM培養(yǎng)液反復沖洗3次，在DMEM培養(yǎng)液浸潤下剪棄根尖1/3牙髓組織，其余部分剪成0.5 mm ×0.5 mm ×0.5 mm 的碎塊，以含200 mL/L胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液，在 37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中孵育。待組織塊貼壁后隔日半量換液。倒置相差顯微鏡下逐日觀察細胞的形態(tài)特征和生長情況。細胞出現融合以胰蛋白酶消化法(20 g/L胰蛋白酶+2 g/L EDTA)收集細胞，按1∶2傳代。取第4代牙髓細胞行波形蛋白、角蛋白單克隆抗體染色。取第5～8代牙髓細胞進行實驗。

1.3 bFGF對人牙髓細胞遷移活性的影響

制備1×106/mL的牙髓細胞懸液。Transwell小室置24孔板中，上室加入200 μL牙髓細胞懸液，靜置培養(yǎng)24 h后棄去上室內培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)基浸洗細胞兩次。下室加入bFGF終濃度為10 ng/mL含10 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液1.5 mL，對照組僅加入等量的含10 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液，PBS浸洗2 min，棉簽輕輕拭去小室濾膜內表面細胞，將小室濾膜外表面細胞以40 g/L多聚甲醛固定10 min，10 g/L結晶紫染色10 min，蒸餾水洗滌5 min，顯微鏡下觀察細胞，每張濾膜隨機取5個視野(×400)計算穿膜牙髓細胞數并取均值。實驗復3孔設計，重復3次。

1.4 bFGF對人牙髓細胞ALP活性的影響

取生長良好的牙髓細胞，制備2×104/mL的細胞懸液，按每孔100 μL接種于4塊96孔板。待細胞長滿孔底后，棄去孔中培養(yǎng)液，以無血清DMEM浸洗細胞兩次，實驗組加入含bFGF終濃度為10 ng/mL含10 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液;對照組僅加入等量的含10 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液，每組20個復孔。在繼續(xù)培養(yǎng)的第1、7、14和21 d后棄孔中培養(yǎng)液，以PBS浸洗3次。每孔加入1 g/L Triton X－100各50 μL，4℃過夜，鏡下觀察細胞完全裂解后，分別加入 ALP底物混合液200 μL，37℃孵育30 min，以0.5 mol/L氫氧化鈉液終止反應，室溫振蕩5 min，用酶聯檢測儀選擇410 nm波長，測定每孔吸光度A值，取均值。

1.5 統(tǒng)計分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 人牙髓細胞的形態(tài)學觀察

培養(yǎng)15～20 d，倒置顯微鏡下可見人牙髓細胞從組織塊周圍游離出(圖1a)，多為典型的梭形結構，胞體豐滿，胞漿均勻，核圓形或卵圓形(圖1b)。免疫細胞化學染色結果顯示:牙髓細胞抗波形蛋白染色陽性(圖2a)，抗角蛋白染色陰性(圖2b)。

圖1 人牙髓細胞在倒置顯微鏡下所見(100×)

圖2 人牙髓細胞免疫細胞染色(200×)

圖3 人牙髓細胞遷移情況(200×)

2.2 bFGF對人牙髓細胞遷移活性的影響

培養(yǎng)48 h后，10 ng/mL bFGF組細胞遷移數明顯多于對照組(圖3)，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(表1)。

表1 bFGF對人牙髓細胞遷移活性的影響(個，)

表1 bFGF對人牙髓細胞遷移活性的影響(個，)

組別 n 細胞遷移數 相對遷移率(%) P值3 15.58 ±1.49 － －bFGF組對照組3 40.61 ±3.35 260.65 0.00

2.3 bFGF對人牙髓細胞堿性磷酸酶活性的影響

從第7天開始，與對照組相比，10 ng/mL的bFGF可明顯抑制體外培養(yǎng)牙髓細胞的ALP活性(P＜0.05)。bFGF組各時間點間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)(表2)。

表2 bFGF對人牙髓細胞ALP活性的影響(OD值，)

表2 bFGF對人牙髓細胞ALP活性的影響(OD值，)

*與對照組相比P＜0.05

0.030 bFGF 組 0.276 ± 0.035 0.323 ± 0.035* 0.353 ±0.045* 0.369 ±0.0561 d 7 d 14 d 21 d對照組 0.303 ±0.043 0.408 ±0.025 0.481 ±0.029 0.600 ±組別*

3 討論

牙髓組織中存在具有自我更新和多向分化潛能的牙髓干細胞［2］。在受到傷害性刺激以后，這些間充質細胞遷移到相應的病變部位，發(fā)生增殖。并分化為成牙本質細胞從而形成修復性牙本質，參與牙髓組織修復再生過程［3－4］。在牙髓組織的修復過程中，儲存于牙本質中的生長因子會被釋放出來，受損的成牙本質細胞以及炎癥細胞亦可以釋放細胞因子，直接參與牙髓組織的修復再生過程［5］。

bFGF是成纖維生長因子家族的重要成員之一，在牙齒發(fā)育中對細胞的增殖和分化起重要作用［1］。Morito［6］的研究表明:bFGF 可體外誘導具有干細胞特性的牙髓細胞向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化。譚震等［7］研究表明bFGF可誘導體外培養(yǎng)的成骨細胞和牙周膜細胞增殖和遷移。

在組織損傷或感染過程中，通常伴有特定細胞向損傷部位的遷移。牙髓組織在受到傷害性刺激之后，未分化的間充質細胞向病變部位的定向遷移對后續(xù)的牙本質牙髓復合體修復起著決定性作用。本研究采用Transwell小室法［8］研究bFGF最佳顯效濃度［9－10］10 ng/mL對體外培養(yǎng)人牙髓細胞遷移活性的影響，結果表明bFGF可有效誘導牙髓細胞遷移(P ＜0.05)，與 Shimabukuro［11］的“硅塊誘導”法研究結果相一致。說明bFGF作為一種信號分子，可誘導牙髓細胞向損傷部位遷移，促進牙本質牙髓復合體的修復。

ALP是參與鈣化組織代謝和再生的一種功能性標志酶［12］，牙髓組織中的ALP活性可以反映牙髓成纖維細胞向成牙本質樣細胞分化的能力。本研究觀察10 ng/mL的bFGF對體外培養(yǎng)的人牙髓細胞ALP活性的影響，結果表明bFGF可以抑制體外培養(yǎng)牙髓細胞的ALP活性，且隨著培養(yǎng)時間的延長，該抑制作用更加顯著(P＜0.05)，與Shimabukuro［11］、Morito［6］的結果相類似。提示 bFGF 抑制牙髓細胞進一步分化成熟為礦化組織形成細胞。

近年來研究表明:在牙髓的修復再生過程中，多種生長因子相互作用構成功能性網絡，作為始動信號啟動修復的過程。牙髓組織的修復再生過程復雜，需要多種生長因子、細胞外基質以及細胞本身特性的綜合作用。bFGF在這個復雜的調控網絡中究竟起多大作用，與其他因子的協同作用和量效關系如何，還有待進一步的研究。

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