微生物細(xì)胞脂肪酸的組成分析

柳志杰，章 輝，周 利，花 強(qiáng)

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂，是微生物在一定條件下產(chǎn)生并儲(chǔ)存于菌體內(nèi)的甘油脂，其脂肪酸組成以C16、C18系脂肪酸(如硬脂酸、油酸和亞油酸)為主。將微生物油脂進(jìn)行酯化反應(yīng)，可以獲得生物燃料[1，2]。脂肪酸含量及組成可以作為微生物分類鑒定的指標(biāo)[3～5]，相對(duì)于抗原檢測和雜交，具有不需要探針的優(yōu)勢；在代謝組學(xué)研究中，微生物細(xì)胞脂肪酸組成及含量的動(dòng)態(tài)變化可以反映細(xì)胞的代謝狀態(tài)[6]。因此，微生物脂肪酸組成及含量分析具有重要的意義。

文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞內(nèi)油脂總含量的分析方法有蘇丹黑B染色法[7]、磷酸香草醛法[8]以及尼羅紅染色法[9]，但這些方法均無法分析細(xì)胞油脂脂肪酸的組成。而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)[10]可以直接通過圖庫檢索得到樣品的信息，不需要再通過標(biāo)樣比對(duì)進(jìn)行樣品的確認(rèn)，分析方便，具有普遍的應(yīng)用意義。因此，作者在此采用GC-MS法，對(duì)油脂酵母皮狀絲孢酵母的油脂分布以及脂肪酸組成進(jìn)行分析，擬為微生物細(xì)胞脂肪酸的分析應(yīng)用提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與試劑

油脂酵母皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)，自行保藏。

三氟化硼溶液、癸酸(C10：0)，Sigma公司；其它試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖12.0，(NH4)2SO40.4，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 0.5，L-組氨酸0.03，L-亮氨酸0.125，L-蛋氨酸0.025，尿嘧啶0.04，微量元素溶液1 mL，維生素溶液1 mL。

微量元素溶液(g·L-1)：EDTA 15.0，ZnSO4·7H2O 4.5，CoCl2·6H2O 0.3，MnCl2·4H2O 1.0，CuSO4·5H2O 0.3，CaCl2·2H2O 4.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 3.0，NaMoO4·2H2O 0.4，H3BO31.0，KI 0.1。

維生素溶液(g·L-1)：D-生物素0.05，泛酸鈣1.0，煙酸1.0，維生素B11.0，維生素B61.0，對(duì)氨基苯甲酸0.2，肌醇25。

1.3 培養(yǎng)條件

將對(duì)數(shù)生長中期的種子液接種到裝有0.8 L培養(yǎng)基的1.5 L發(fā)酵罐中，于30 ℃、480 r·min-1培養(yǎng)，通氣量1.5 vvm。發(fā)酵過程中的溶氧、pH值、尾氣等數(shù)據(jù)全部使用Biostar軟件進(jìn)行在線采集。

1.4 微生物細(xì)胞油脂的提取[11]及脂肪酸組成分析

采用酸熱-有機(jī)溶劑萃取法提取微生物細(xì)胞油脂：離心收集菌體；向菌體中加入適量4 mol·L-1HCl溶液，浸泡30 min，煮沸10 min；置于冰上速冷，孵育；加入4 BV的甲醇-氯仿(1∶2，體積比)溶液，混合，封口，置于搖床中于180 r·min-1萃取30 min；12 000 g離心5 min，取下層有機(jī)層；重復(fù)萃取1次；將所收集的有機(jī)溶劑過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，稱重。

將油脂溶解于3 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鉀-甲醇溶液，75 ℃水浴20 min；加入3 mL 14%三氟化硼溶液，75 ℃水浴20 min；加1 mL飽和氯化鈉溶液，再加入適量癸酸作為內(nèi)標(biāo)，離心取上清，在氮?dú)庀麓蹈?，用正己烷定容；過濾，用GC-MS法分析脂肪酸組成。

GC-MS分析條件：采用Agilent 6890-5975型氣質(zhì)聯(lián)用儀。氣相色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：180 ℃保留2 min，以5 ℃·min-1升溫至250 ℃；載氣(氦氣，純度≥99.996%)流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量0.2 μL；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃；-70 eV轟擊；質(zhì)譜儀掃描范圍70～560m/z；溶劑延遲1.5 min。

1.5 分析測試

(1)細(xì)胞干重的測定：取一定量發(fā)酵液于4 ℃、12 000 g離心10 min，用去離子水洗2次后置于85 ℃烘箱中烘至恒重，稱重。

(2)葡萄糖濃度的測定：采用HPLC法。Agilent 1200型高效液相色譜儀，配示差折光分析檢測器；色譜柱為Spherisorb NH2柱(0.46 cm× 25 cm，7 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(80∶20)；流速1 mL·min-1；檢測器溫度 40 ℃，柱溫40 ℃。

(3)氮源濃度的測定：采用苯酚-次氯酸鈉法[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌體生長及油脂積累情況(圖1)

圖1 皮狀絲孢酵母菌體生長及油脂積累情況

由圖1可以看出，皮狀絲孢酵母的生長可以分為兩個(gè)時(shí)期：菌體生長期和油脂積累期。0～24 h，菌體快速生長，細(xì)胞內(nèi)油脂含量基本不變，為菌體生長期；24 h后，氮源消耗完，菌體生長變慢，細(xì)胞內(nèi)油脂含量不斷升高，60 h時(shí)，葡萄糖耗盡，油脂含量達(dá)到最大值31%，為油脂積累期。

2.2 菌體細(xì)胞油脂脂肪酸的組成分析

皮狀絲孢酵母體內(nèi)積累的油脂經(jīng)酸熱-有機(jī)溶劑萃取、甲酯化處理后進(jìn)行GC-MS分析，得到的總離子流圖見圖2。

1.Decanoic acid，methyl ester(internal standard) 2.9-Hexadecanoic acid，methyl ester，(Z) 3.Hexadecanoic acid，methyl ester 4.9，12-Octadecadienoic acid (Z，Z)-，methyl ester 5.9-Octadecenoic acid (Z)-，methyl ester 6.Octadecanoic acid，methyl ester

由圖2可以看出，脂肪酸甲酯得到了很好的分離。菌體細(xì)胞油脂脂肪酸組成主要為油酸(C18：1)、軟脂酸(C16：0)、棕櫚油酸(C16：1)、硬脂酸(C18：0)和亞油酸(C18：2)。

對(duì)皮狀絲孢酵母油脂脂肪酸的積累及組成進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 皮狀絲孢酵母油脂脂肪酸的積累情況

圖4 皮狀絲孢酵母油脂脂肪酸的組成

由圖3和圖4可以看出，菌體細(xì)胞在發(fā)酵過程中主要積累油酸(C18：1)，其次為軟脂酸(C16：0)和棕櫚油酸(C16：1)，硬脂酸(C18：0)積累速率較慢，亞油酸(C18：2)基本不積累。脂肪酸組成變化：軟脂酸(C16：0)、棕櫚油酸(C16：1)、硬脂酸(C18：0)所占比率基本不變，油酸(C18：1)所占比率升高，亞油酸(C18：2)所占比率降低。通過發(fā)酵，最終得到的皮狀絲孢酵母油脂脂肪酸組成為：油酸(C18：1)64.80%、軟脂酸(C16：0)19.90%、棕櫚油酸(C16：1)10.94%、硬脂酸(C18：0)3.72%、亞油酸(C18：2)0.56%。

3 結(jié)論

對(duì)油脂酵母皮狀絲孢酵母細(xì)胞油脂進(jìn)行提取，并應(yīng)用GC-MS對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，菌體的代謝狀態(tài)分為兩個(gè)時(shí)期：菌體生長期和油脂積累期；菌體細(xì)胞主要積累油酸(C18：1)、軟脂酸(C16：0)和棕櫚油酸(C16：1)；通過發(fā)酵，最終得到的皮狀絲孢酵母油脂脂肪酸組成為：油酸(C18：1)64.80%、軟脂酸(C16：0)19.90%、棕櫚油酸(C16：1)10.94%、硬脂酸(C18：0)3.72%和亞油酸(C18：2)0.56%。GC-MS可以很好地用于脂肪酸甲酯的分析，具有普遍的應(yīng)用意義。

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